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      與色譜柱相關的100個問題,最好是耐心的讀下去!

      放大字體  縮小字體 發布日期:2021-11-17  瀏覽次數:617
      核心提示:色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分

      色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相,以及色譜柱的制備和操作條件。

      關于色譜柱的疑問小編搜羅了100個問答,希望能夠幫到你。

      1.網上對柱子是否可以反沖一直有爭論,那什么樣的柱子可以反沖,什么不可以。反沖后是正著用,還是反著用。具體到各型號柱子不僅是ODS柱,其他如,正向柱、氨基柱、離子交換柱等最好都有解釋。

      答:一般的正相反相柱應該都能反沖,只有兩端篩板孔徑不對稱的柱子不能反沖,不過目前這樣的柱子已經比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉,反沖后還是正著用比較好,以免柱子的兩頭都被污染,我們一直提倡的是:正向使用,反向沖洗。


      2.我在做方法開發的時候,用乙腈和水作為流動相,在調整梯度的時候發現,剛開始用60%乙腈,RT為2.5分鐘,調到40%乙腈,RT沒有變化,30%也沒有變化,一直調到20%的時候,RT突然變到了約13分鐘,請問這是什么原因?我用的是離子交柱。

      答:離子交換柱的保留時間主要由洗脫液的離子強度和pH決定,你現在講的比較簡單,需要把你的方法說的詳細一點才能做具體的分析。譬如,分析物是什么情況,其含有極性電離基團和非極性基團是什么性質?離子交換柱是聚合物基質還是硅膠基質?水相是什么緩沖鹽?


      3.對于一根常用的C18柱,拿到一根新柱的時候應該怎樣進行活化及維護?為什么要這樣做?

      答:新柱活化,實際上是一個平衡的過程,除了用流動相平衡外,有時候還必須用所測樣品對新柱進行平衡,特別是測定分子量比較高的多肽,尤其重要。因為,分子量高的物質分子,擴散速度慢,平衡所需時間也相應較長。具體平衡方式也很簡單,多進幾次樣品,直到峰面積和保留時間穩定,再進行正式進樣測定。

      如果要加快平衡時間,把前面用來平衡的進樣樣品濃度加大,或者不等洗脫完成,連續進樣多針。用待測物對新柱平衡,目的是:將硅膠基質填料表面具有非特異性吸附的位點的吸附能力飽和掉。


      4.測定多肽,一般采用什么柱子?流動相是乙腈和水,還有微量的TFA。特別是像類似三肽的短肽,應該怎么選擇柱子?

      答:分子量不高的多肽一般選用常規C18柱就能測定,也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的。


      5.氨基柱在進酸性樣品時,很傷柱子,如使用一段時間后,柱效降低,峰形改變,如何恢復?

      答:氨基柱測酸性樣品,應該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會使略帶負電荷的氨基官能團質子化,導致使用一段時間后對于某些類的分析物保留性質有所改變或表現在柱效下降。建議:用5~10倍的柱體積的含0.5~1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當然要再用不含堿的流動相洗去多余氨),之后,再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如,0.1%。


      6.色譜柱的技術都有哪些?比如,封尾等,這些技術在應用時都體現在哪里?

      答:色譜柱技術包括填料技術和裝柱技術,填料技術自不待言,填料的好壞對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術也沒有想象中的這么簡單,不同固定相、不同粒徑、不同柱管內徑和長度,裝柱工藝都有所不同,要裝出緊密、穩定、均一的柱床,更多是一門藝術,需要經驗積累。


      7.色譜柱技術的差距在哪里?

      答:色譜柱技術包括填料技術和裝柱技術,填料技術自不待言,填料的好壞對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術也沒有想象中的這么簡單,不同固定相、不同粒徑、不同柱管內徑和長度,裝柱工藝都有所不同,要裝出緊密、穩定、均一的柱床,更多是一門藝術,需要經驗積累。

      國內和國外相比,我認為色譜柱的差距在于:國內公司以前都不會自己開發填料,一般買國外現成填料裝柱,買到的填料質量控制權不在自己手里。另外,因為,裝柱歷史短,經驗積累少,裝柱工藝也沒有完全達到國外水平。另外,對色譜柱性能很關鍵的基礎材料——裸硅膠,國產的還不過關,在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國外產品相比,差距很大。


      8.柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢?原來也討論過這個問題,我也拆下來清洗過,但我看到柱前段的污染更甚,于是就用刀片刮了刮,然后把清洗好的篩板安裝上去。問題解決了,但使用壽命會不會減少呢?

      答:柱頭污染了,就取出污染的,再裝一些填料。因為,加入你刮了些填料,那么微觀的塔板數就少了。假入你刮得不多,僅表面,可能就是一些臟物,所以,問題解決,但是,今后還會有同樣問題,再掛,那么不小心刮,影響柱效。建議還是裝一個預柱。


      9.如果柱子取下來放置一段時間,需要做什么保護嗎?

      答:對一般的反相柱,也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中,然后用堵頭塞緊柱兩頭,以免保存溶劑揮發,應該不需要做特殊的保護。


      10.流動相中加入適量的四氫呋喃可以改善峰形的機理是什么?

      答:《高效液相色譜方法及應用》于世林編著的上面說:甲醇為質子給予體、乙腈為質子接受體、四氫呋喃是偶極溶劑,應該除了極性影響,還有另外的影響因素,至于分離機理,還是比較復雜的,不能看成是個萬能方法。


      11.關于色譜柱的填裝問題!我個人認為現在色譜柱的填裝一般有3種情況:

      ①國外生產填料并填裝完成成品賣到國內;

      ②國外生產填料,國內填裝銷售;

      ③國內生產填料,國內填裝銷售。

      一般情況下,第1種情況賣的最貴,也質量最好!可是我就不明白了:如果是填料的生產很復雜的話,那么填裝上國內也跟不上去嗎?為什么換在國內填裝就會出現或多或少的一些小問題呢?

      答:國內填裝會出現質量小問題,和國內目前普遍做事沒有國外嚴謹有關吧。如果工藝技術上沒有問題,又能制訂并切實執行一整套嚴格的生產質量管理措施,國內填裝和國外填裝并無區別。


      12.國產色譜柱在市場上占有比例如何?

      答:國內色譜柱市場還沒有人進行過科學統計,連一年色譜柱銷售總量也眾說紛云,更別說國內生產色譜柱所占份額了。我估計是占30%左右吧。


      13.預柱或保護柱用還是不用的問題!原來分析中藥品種時,我一直都是用保護柱。但來到新公司后,發現大家都沒有使用,幾個實驗室連保護柱都沒找到一個,也就是說大家從來都沒有用過。后來問一個老員工,說是有可能影響藥品分析。我就想問:安裝保護柱后會影響樣品分析嗎?我們做的大多是頭孢類的抗生素。

      答:應該這樣說,加上保護柱,肯定有利于保護色譜柱不受一些顆粒物質的堵塞,肯定有害于分離度和柱效,因為保護柱中間有著死體積的存在但是如果保護柱接得好并且盡量控制其匹配性和經常更換,分離度和柱效應該影響并不大。

      頭孢類的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍,有些原料藥,可以根據色譜柱的損耗選擇添加預柱(中間是個篩板),制劑的話,如果有輔料嚴重干擾或者流動相鹽分比較大,那還是最好配個保護柱。


      14.用的是四元梯度泵A50%甲醇;B50%, 經常出現;蜻M氣泡這是什么原因?

      答:水/甲醇比例在55:45時,黏度和柱壓有個極大值。50:50接近了這個極值,柱壓是比較高的,但,影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內徑,你這個實例中不知用的什么規格的色譜柱?系統壓力高,可能會因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導致氣泡進入系統,停機也應該是因為氣泡進入壓力下降的原因,可考慮更換液體通量更大的過濾頭。


      15.填料方法的前三種都是濕法嗎,能不能對四種填充方法做一個簡短的說明?

      答:資料顯示:在正常條件下,填料粒度>20µm時,干法填充制備柱較為合適;顆粒<20µm時,濕法填充較為理想。填充方法一般有4種:

        高壓勻漿法,多用于分析柱和小規模制備柱的填充;

        徑向加壓法,Waters專利;

        軸向加壓法,主要用于裝填大直徑柱;

      干法,柱填充的技術性很強,大多數實驗室使用已填充好的商品柱。為什么以20μm為分界點?


      16.想請您具體說明一下反沖色譜柱的方法,是不連檢測器嗎?

      答:反沖就是將柱子反向連到系統中。因為,有污染物反沖出來,當然不連檢測器,出液端直接接到廢液瓶就可以。


      17.如果不使用不銹鋼接頭,而改peek頭,是否可以完全解決接頭匹配問題?

      答:色譜柱接頭其實大都不是色譜柱廠商自己生產的,供貨商有多個,VICI,Upchurch,Parker等,他們的標準相互之間不統一,那色譜柱接頭的標準就統一不起來。不過一般這個問題也不難解決的,換個接頭就可以了,而且現在有了萬用接頭,可以配所有不同類型的柱頭,不泄露,連接死體積又很小。


      18.有的廠商為避免堵塞,使用了較大孔徑(25μm)的前篩板,這種情況反沖會將填料沖出。那么,你們在使用說明書中會說明前后篩板的孔徑嗎?

      答:如果前后篩板孔徑不對稱,廠商肯定也會在說明書里特別提到的。


      19.我在做多肽藥物時遇到下列問題:

      1)基線不穩定波動大,流動相 A 

      1%TF,A:水溶液,B:1%TFA乙腈溶液檢測波長210nm流速1.0mL/mL 什么原因?怎么解決?TFA有什么作用?流動相中不加TFA見不到主峰,基線良好;

      2)做完肽類樣品時怎么沖洗C18比較好;

      3)藥典上介紹測定分子量大于2000的樣品,選擇柱子填料的孔徑為30nm,30nm10nm對結果有什么區別?

      答:應該是起“離子對”的作用吧。在做多肽類樣品的時候,300A孔徑的填料相對100A孔徑肯定要選擇性好點,也就是分離度相對比較好點。流動相加入TFA,在反相色譜分離多肽和蛋白質的實驗中,使用三氟乙酸(TFA)作為離子對試劑是常見的手段。流動相中的三氟乙酸通過與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用,來改善峰形、克服峰展寬和拖尾問題。

      三氟乙酸優于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發,可以方便地從制備樣品中除去。另一方面,三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm ,對多肽在低波長處的檢測干擾很小。


      20.waters,Atlantis C18柱可以用較高比例的流動相,那么用完后應該怎么清洗?在什么體系中保存比教合適?

      答:反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護:
      流動相中不含緩沖鹽     
      分析完成后,用甲醇(或乙腈):水=90:10反向沖洗色譜柱45min。
      流動相中含有緩沖鹽:      
      分析完成后,先用甲醇(或乙腈):水=10:90反向沖洗45min,然后再用甲醇(或乙腈):水=90:10反向沖洗色譜柱45min;(注意:甲醇(或乙腈):水=10:90容易長菌,使用時間不可超過3天);

      水性柱保存體系也不特別:

      短期保存在所用的流動相中(不含緩沖鹽),中長期保存在純甲醇(乙腈)或80%的甲醇(乙腈)/水中。


      21.正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適?

      答:短期和長期都建議保存在正相測定所用的流動相中,一般是正己烷和極少量的異丙醇。


      22.磷酸鹽緩沖鹽滲透力強,為什么,是因為與醋酸鹽,枸椽酸鹽相比,基團小嗎,使用磷酸鹽緩沖液與其它緩沖液相比,會使色譜柱壽命縮短多少?

      答:經常用磷酸鹽,在其它條件差不多一樣的情況下,柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對短一些。但用磷酸鹽也有不可取代的優點吧,否則不可能現在大部分人還在用。

        

      23.反相離子對色譜法中,離子對是如何起作用的,是離子對試劑的非極性端溶解在填料的非極性端里,解離端伸向流動相,對含胺化合起離子交換作用,還是樣品與離子對生成緊密的結合物,離子對試劑掩藏化合物中的極性基團,還是這種結合物是在解離與結合的動態平衡之中?

      答:首先離子對試劑的解離端和目標離子形成離子締合物,降低其極性,這樣就能較好的在柱子上保留。再者,根據疏水效應理論,離子對試劑的疏水端是很容易和C18鏈相互作用的,這樣更容易在柱子上保留,所以我認為離子對試劑作用是混合保留機制,即純粹的反相保留和離子對保留機制共同作用。


      24.四烷基季銨鹽(如,四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等)在水中電離后,也形成了類似NH(CH2CH3)3的結構N(CH2CH2CH2CH3)4,這種結構也能有效的與SiO-產生較強的靜電作用,此類離子對用的比較少,但它的作用僅是掩藏SiO-嗎,它對物質的保留性能有何影響,實驗中發現檢測胺化物時,流動相中加入磷酸緩沖鹽有增加物質保留的趨勢,而加入三乙胺則會降低物質的保留能力?

      答:前面提到的四丁基氫氧化銨等離子對試劑確實不如辛磺酸鈉等極性基是陰離子的離子對試劑用得普遍,原因是酸類極性物質很容易通過降低pH值的方法提高在反相色譜中的保留能力,降低pH可抑制酸的電離,使酸處于中性狀態而與疏水碳鏈的作用力增強。而堿類分析物則受硅膠基質pH上限的嚴重影響(以前上限是8,后來抬到10,直到最近雜化硅膠才將pH上限提到12左右)。

      銨鹽類離子對試劑確實有辛磺酸鈉等所不具有的屏蔽硅醇基作用,但其主要作用還是疏水端和疏水固定相結合,外露的陽離子親水端和酸陰離子作用,從而提高其保留能力。當然同樣還有第二種解釋機理,離子對試劑先和分析物結合,掩藏極性基,從而提高極性分析物在反相色譜中的保留能力。而且丁基比辛基疏水性差,這種情況下,認為后面的結合機理占上風的可能性更大。
      檢測胺類化合物,加入三乙胺預先和硅醇基結合,胺和硅醇基作用被三乙胺取代,保留下降是肯定的。


      25.同一根色譜柱在分析完三聚氰胺后,再分析苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時為什么保留時間會提前?

      答:色譜柱被強保留物質污染后,保留時間提前和滯后的情況都有,具體要看污染物的性質,還要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情況,情況比較復雜,有時候比較難預測是提前還是滯后。不過你平時維護的時候,注意在測定后將污染物用有機溶劑反沖清洗,就可以減輕或避免這種情況的出現。建議每個分析方法用專門的色譜柱,長遠看,這樣更節省色譜柱的費用。


      26.HPLC柱前衍生和柱后衍生的相關問題?1)為什么要衍生?2)衍生化的分類?3)進行衍生,適用的化合物有哪些?4)進行衍生化的要求有哪些?5)柱前衍生和柱后衍生的優缺點?

      答:色譜技術中的化學衍生法系指在色譜過程中用特殊的化學試劑(一般稱為衍生化試劑或標記試劑)使樣品成分轉變相應的衍生物之后進行分離檢測或進行檢測的方法。

      目的為:

      1.將紫外—可見強吸收功能基團引入被檢測對象或將其轉變為熒光衍生物,以提高檢測靈敏度;2.提高對分析樣品的分離和選擇性。

      從是否與HPLC系統聯機的角度,化學衍生法分為在線online)與離線∣Offline)兩種。從發生衍生化的場合,分為柱前衍生法pre-columnderivatization)與柱后衍生法(post-columnderivatization)兩種。目前,在HPLC中,以離線的柱前衍生法(簡稱柱前衍生法)與在線的柱后衍生法(簡稱柱后衍生法)使用居多。


      27.多個樣品不好分離的時候,請問該怎么通過選擇合適的柱子來提高分離度?

      答:提高分離度可從三個主要影響因素來考慮,柱效、選擇性和保留因子?赏ㄟ^減小填料粒徑和增加柱長提高柱效;選擇性和固定相選擇以及pH條件有關,通過選擇合適的色譜柱和合適的pH,可以提高選擇性;有時候適當延長出峰時間增加保留因子,也可提高分離度。


      28.苯基柱,氰基柱該什么時候考慮用?

      答:苯基柱用于含苯環的芳香族化合物的測定時,具有較高的選擇性。CN柱可作為一個保留能力最弱的反相柱使用,也可作為一個活性降低的正相柱使用(保留時間比硅膠柱和氨基柱低很多)。


      29.同樣類型柱子還有長度,粒徑等差異,這些該怎么去選擇?

      答:長度和粒徑都是用來改變柱效的,選擇原則是夠用就好。


      30.我前幾天剛剛裝上一個新的C18柱,在進樣之前我用100%的甲醇沖了半個多小時。剛才看到上面寫的要活化什么的?不知道我只沖洗半小時就開始用對柱子有沒有影響?對出峰什么的有沒有影響呢?

      答:不是所有的測定,都需要對新柱子用所測樣品老化。但先按方法程序進樣幾針,觀察到峰面積保留時間不再有明顯變化,再開始正式測定,這是一個好習慣。按你現在的做法,如果第一針和第二針的峰面積、保留時間沒有變化,就繼續做沒影響吧。


      31.現在色譜柱和儀器的接口還沒有標準化嗎,除了檢測池的出入管較小外,色譜柱的接口與peek頭不匹配的有哪個型號的色譜柱,以后使用的時候需要注意一點。同時發現使用過金屬接頭的色譜柱再換成PEEK頭,常易漏液,這是因為金屬頭易使色譜柱接口變形嗎?

      答:色譜柱接頭其實大都不是色譜柱廠商自己生產的,供貨商有多個,VICI,Upchurch,Parker等,他們的標準相互之間不統一,那色譜柱接頭的標準就統一不起來。不過一般這個問題也不難解決的,換個接頭就可以了,而且現在有了萬用接頭,可以配所有不同類型的柱頭,不泄露,連接死體積又很小。


      32.普通的C18柱能作為正相色譜柱使用嗎?正相色譜體系中最常用也最普通的是那種色譜柱。正相柱在使用過程中與反向柱相比有什么需要注意的地方?

      答:普通C18柱作為正相柱使用,我還沒聽說過。正相色譜分離模式是指固定相的極性比流動相的極性大,反過來,流動相極性大就是反相。C18固定相屬于疏水性相對比較強的,疏水性強就是極性很弱,應該找不出極性比它更弱的流動相了。

      正相體系常見的柱子有:硅膠柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱,最普通的應該就是硅膠柱。正相柱和反相柱比,最需要注意的是水分,正相柱對水分非常敏感,流動相中水分含量的些微變化對保留時間影響很大,因此正相柱測定前平衡時間需要幾個小時甚至更長。


      33.色譜柱的柱頭類型與不銹鋼毛細管接頭有6種連接方式(在講義里面提到),那么我們用戶一般是液相色譜儀是固定某一個廠家,而是根據樣品檢測需要更換不同類型的色譜柱,那么怎么判斷我所購買的色譜柱是否與不銹鋼毛細管是否匹配呢,我之前只是知道安捷倫和waters都有規定他們自己家的柱子與自己家的儀器配套是最合適的,而其他廠家的色譜柱都很少提及,在不知道的情況下,我們該怎么選擇?月旭的色譜柱柱頭類型屬于哪一種類型呢?

      答:不銹鋼毛細管接頭有個缺點,用過一次后卡匝位置和距離毛細管末端的長度就固定死了。如果下次用的色譜柱的柱頭接口深度和原來的不同,就容易產生死體積和泄漏。產生的死體積一般不大,如果只引起柱效的稍微下降而沒引起拖尾,這個問題就容易被忽略。引起大家關注的是泄漏,如果用了新柱子,發現和毛細管的接口處有泄漏,就可以判斷是接頭的匹配問題。最好的判斷方法還是:詢問一下廠商色譜柱柱頭的類型和柱頭接口的深度,然后和毛細管接頭的規格比較。

      如果用peek接頭,發生問題的情況就大大減少,因為,peek接頭卡匝位置是不固定的。

      接頭與色譜柱的匹配,并沒有在實際色譜應用中造成很大的問題,有很多人都沒有關注到這個問題。一方面原因是使用peek接頭的情況很普遍,另外,如果發現不匹配,換個毛細管接頭還是非常方便的。


      34.相對于氣相色譜,液相的優勢在哪里?做防腐劑分析時,流動相加入乙酸銨才可以出峰,原理是什么?

      答:液相和氣相相比的優勢有很多,我認為主要在于應用范圍更廣。氣相只限于容易氣化的低分子量物質的分析測定,對象大部分是基礎化工原材料;而任何能溶解于某溶劑的物質都能用液相分析,適用對象是分子量從幾十到幾萬的廣大范圍。在制藥、化工、環保、食品和刑偵等諸多重要領域,液相都已成為主導的分析分離工具。也有兩者都能應用的交叉情況,但液相的制樣更簡單。液相色譜的出現克服了氣相色譜不能直接用于難揮發、熱不穩定及高分子化合物的弱點。


      35.提到“磷酸鹽緩沖鹽滲透力強,有加快硅膠溶解的副作用,它的存在會降低pH使用范圍。”,既然這樣,經常使用,柱子壽命是否也下降的快呀?

      答:經常用磷酸鹽,在其它條件差不多一樣的情況下,柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對短一些,但,用磷酸鹽也有不可取代的優點吧,否則不可能現在大部分人還在用。


      36.CN柱的保存需要在低溫條件,但是,又不能太低,使固定相凍結,怎么控制這個溫度?怎么判斷固定相是否被凍結?固定相凍結后會是什么樣的現象?

      答:所謂低溫儲存,就是放到陰涼處或者放到冰箱的冷藏室。儲存液只要不是純水,冰點都比較低,純甲醇的冰點是零下90度以下了。


      37.我們測試樣品時,經常會關心柱壓是否太高,但是在購買色譜柱時,并沒有說每一根色譜柱的最大使用壓力是多少?針對這樣的情況,用戶怎么判斷柱壓是否超過該柱的極限?

      答:裝柱時的壓力比使用時高很多,所以柱壓對色譜柱本身在使用時沒有極限問題存在,倒是一般儀器有個40Mpa的上限。如果色譜分離度還能滿足分析方法要求,柱壓只要儀器能承受就OK吧。


      38.使用緩沖液不當,使硅膠溶解并重新形成粉末后,會出現什么樣的異常情況?怎么處理?

      答:出現異常就是柱壓升高。小粉末在流動相不斷沖洗帶動下,最后會聚集在柱子出口端,沉積在后篩板。處理方法只有拆下后篩板進行清洗或更換,但這樣做會影響到柱床,處理后柱效會下降。

       

      39.今天才知道濾膜的材質分了這么幾種:再生纖維素、聚四氟乙烯、硝酸纖維和醋酸纖維等,之前只知道有有機系和水系之分?各種不同材質的濾膜適合于什么樣的樣品?

      答:再生纖維素膜:具有蛋白質吸收低,適用于水溶性樣品和有機溶劑;

      聚四氟乙烯:適用于所有有機溶劑,酸和鹽;

      尼龍66適用于絕大多數有機溶劑和水溶液,可用于強酸,70%的乙醇,二氯甲烷,不適用與二甲基甲酰胺;

      醋酸纖維:不適用有機溶劑,特別適用水基溶液。


      40.我原來遇到個這樣的問題,一直不知道原因。剛拿柱子做,色譜條件是成熟的,絕對沒問題,但是該條件下保留的物質變的不被保留,比如,本來保留時間15分鐘卻怎么調比例都是23分鐘就出峰了,維護后,下次再使用又正常了,什么樣原因?

      答:最大可能是發生相塌陷了。C18柱和高密鍵合封尾的C8柱,在高含水流動相下會發生相塌陷,后果就是保留能力大幅下降。用有機相比例較高的流動相沖洗后,又可恢復正常性能。


      41.UPLC色譜柱可以反沖嗎?HPLC的色譜柱可以簡單反沖,但是,UPLC的色譜柱.也是一樣的嗎?如果壓力偏高,該怎么辦?

      答:如果兩端篩板孔徑對稱,UPLC柱應該也是可以反沖的。發現壓力偏高,當然也可以用反沖清洗的方法維護,UPLC柱和普通色譜柱比,只是壓力高一點,不應該有什么特殊吧。


      42.常規LC的柱子粒度小,柱效高,現在有3.5μm的常規柱,不知道用3.5μm*250的壓力與4.6μm的壓力相差多少?

      答:一般柱子4.6mm×250mm指的是其內徑和長度。粒徑才用μm的單位,但一般標的是5μm,也有3.5μm的。其它條件一樣,光粒徑是3.5μm和5μm的柱壓差別,理論上3.5μm柱子的柱壓是5μm柱子的(5/3.5)平方倍數,即,2.04倍,簡單說就是2倍。


      43.因為,不知道流動相已走完,液相色譜柱空走了大概一晚上,請問這種情況下柱子還能用嗎?如果可以應該如何再生?

      答:能用的!可能柱子里會有氣泡進去,但之后,多用流動相沖沖,看到基線穩定,就沒問題了。用色譜柱的保存液低流速長時間沖洗,然后,再檢測一下柱效,看柱子是否恢復,液相最好設置一下最低壓限,這樣就不怕流動相走光而會損傷色譜柱。


      44.在梯度洗脫的時候,如果整個時間程序越長,保留時間的重現性越差,尤其是后出的峰重現性差更明顯,我猜估計是流量本身的誤差引起的,但是怎么盡量避免這種情況的出現,使保留時間重現性更好?

      答:這個要控制好環境溫度和柱溫,易揮發的流動相要適當密封,同時,保留時間的漂移與儀器的精度也有關系。


      45.我對聚苯乙烯-二乙烯苯柱很有興趣,主要是它耐高溫、耐酸堿、但有關這方面的文獻很少,但對于他的分離效能我一直心里沒底,我的問題有三:

      1)分離效果與ODS比較,是相當呢,還是更勝一籌,或是更差?

      2)我原以為它是整體住,但看過資料后發現也是顆粒的比如,5μ,請問該類型的柱是否符合速率理論、是不是粒徑越小分離效果會幾何級的增加?

      3)問什么沒有1.7μ的這種柱出現呢?

      答:聚合物基質色譜柱的優點你已經提到了,它的缺點有:對小分子分離的柱效相對硅膠基質色譜柱要低,表面衍生化修飾也沒有在硅膠表面豐富,機械強度低耐壓性不好,還有碰到某些有機溶劑會溶脹等。。。

      聚合物基質柱當然也符合速率理論!它柱效低主要是因為,分析物在聚合物固定相中的傳質速度比在硅膠表面固定相中慢很多。不過粒徑越小柱效幾何級增加的規律還是有的。1.7μm的硅膠基質填料也是最近幾年才商品化,1.7μm的聚合物基質沒出來也正常,或許永遠都不出來了,因為,聚合物耐壓差,粒徑做這么小,它根本承受不了這個高壓吧,但愿以后會有能抗高壓的聚合物填料研究出來。


      46.我之前有了解過手性色譜柱,之前買過大賽璐的手性柱,其手性柱價格相比普通反相色譜柱,要高出很多倍,不知道是本身柱子裝填技術的難度大還是其他什么原因?它的主要技術關鍵在什么方面?

      答:手性柱技術關鍵在于手性填料的開發,大賽璐公司在手性填料的生產技術方面申請了專利保護,別的廠商不能生產,導致手性柱價格居高不下。前幾年傳說該公司的專利保護期限快到了,國際國內有些公司就想著仿制生產。后來又聽說專利還沒到期,情況不明。


      47.樣品與離子對生成緊密的結合物,離子對試劑掩藏化合物中的極性基團”這句話是什么意思?離子對怎么樣掩蔽化合物中極性基團?不就是通過靜電引力的作用形成離子締合物,來降低其極性的嗎?

      答:離子對色譜是解決強極性物質在反相色譜中保留能力不足的一個有效的途徑。有些堿性極性物質,即使用100%水相做流動相,且無論在色譜柱能承受的pH范圍內怎么去調節pH,保留能力都不夠。如果需要分離的組分中全是可以離子態存在的,那還可以選擇離子交換色譜進行分離。不然的話,就只有選擇離子對色譜方法了,盡管它有流傳的那么多副作用存在。

      離子對試劑含親水基和疏水基,很像表面活性劑,所以一開始離子對色譜也稱為“皂色譜”。離子對作用的機理有兩種解釋,你上面都已經提到了。到底是哪種解釋對,尚無定論,實際上也沒必要去定論,反正兩種解釋都通就可以了。主流的解釋也是你先提到的機理,下面示意圖更直觀:

      我個人認為,兩種機理都可能存在,要看離子對試劑、固定相和分析物這三者本身情況而定。如果離子對試劑的疏水端和固定相之間的結合力相對更強,示意圖的作用機理會占上風。反之,離子對試劑親水端和分析物導致掩藏極性端的作用力更強,你后面提到的機理更可能?傊,要看你用的什么離子對試劑,是何種的分析物等具體情況不同而不同吧。


      48.我們在用的氨基柱時,有時候峰型突然變寬,有拖尾,用一段時間就又好了,不明白是什么原因造成的,如果要再生氨基柱的時候應該怎么做呢?是像您先前回答的問題中提到的,用一定比例的氨水沖洗嗎?氨基柱可以直接用純水沖洗嗎?記得當時買的氨基柱那個使用說明書上說不能用純水沖?是這樣的嗎?如果可以沖的話,一般沖多久?

      答:氨基柱的硅膠孔內的氨基濃度非常高(大約有1mol/L),在有水存在的時候,在孔內形成一個pH=10左右甚至超過10的很強的堿性小環境,并會導致硅膠基體慢慢溶解。不過硅膠基體的溶解會生成酸性的硅醇基,又會降低孔內的pH值,延緩硅膠基體的溶解進程。一段時間后,兩個相反的過程會達成一個動態平衡,從而穩定下來。對你問題提到的這個現象,我想到的是這個原因。

      氨基柱,要看氨基柱的應用模式,是正相還是HILIC?這兩種模式的情況是大不相同的。正相使用,一般很怕有水,但HILIC模式應用,一般流動相是乙腈/水,是不怕水的。不過,鍵合氨丙基基團非常容易水解,所以一般氨基柱不適宜保存有水的溶劑中。作為正相應用時,流動相中要求一點都不能含水,但清洗柱子上的污染物質,是可以含水的,因為,水有強極性,在正相色譜上洗脫能力極強,當然不必用100%純水。氨基柱具體沖洗方法,正相條件按照正相硅膠柱的清洗方法,HILIC模式按C18柱的清洗方法。


      49.采用國標用C18柱測定辣椒精辣度,將辣椒精中添加吐溫系列乳化劑做成水溶辣椒精,請問乳化劑對C18柱是否有影響?

      答:乳化劑和離子對試劑類似,有極性端和非極性端,肯定會對C18柱有影響。不過,如果辣椒精是極性物質,乳化劑的存在可以提高其在C18柱上的保留能力。


      50.公司按照國標測定辣椒紅色素中蘇丹紅含量,標品分離很好,峰也不錯,但是,辣椒紅色素由于跟蘇丹紅性質很相似,且顏色較深,分離效果很差,收得率很低,測定結果偏差很大。該如何處理樣品?色素是否會降低柱效?

      答:色素不會降低柱效,但,辣椒紅色素主峰濃度過大,會影響與臨近雜質峰的分離?煽紤]稀釋樣品或試試用柱效更高的柱子。


      51.通常我們在分析天然藥物成分的時候結構復雜,無法考察組分的PKa值,哪我們如何去選擇最合適的流動相或者是拖尾該怎么改善呢?

      答:如果天然產物中沒有易電離的極性基團,就不需要用緩沖鹽調節pH。如果,天然產物中既有酸性基團,也有堿性基團,譬如,有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的兩性物質,建議將pH用磷酸鹽緩沖鹽控制在2.4(如果是,諸如月旭的Ultimate LP-C18這樣的耐酸色譜柱,還可以調得更低)。

      如果pH控制在6.2~9.0之間,兩個基團都處于離子態,保留能力最差,是最不可取的。如果不清楚復雜物質中含有什么基團,也請將pH調到2.4或更低。因為pH調低,起碼抑制了酸性基團的電離而處于中性分子狀態,而增加酸性基團這個部分在反相色譜中的保留能力;另外,低pH還抑制了硅醇基的活性,有利于獲取對稱的峰形。

      情況不明時候,為什么不建議調高pH呢?一方面一般色譜柱都不能承受pH=9以上的條件。


      52.記得以前拿到C18柱,會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化,這樣做的目的是什么呢?是先用溶劑活化嗎?然后再用樣品?還有測定短肽總是沖出來,該怎么解決呢?就是和溶劑峰出在一起,或者出在溶劑峰之前。

      答:C18柱,會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化,因為,色譜柱到達用戶手中時,時間長短不一,在存儲和運輸的過程中,可能存儲液有些揮發,低流速的甲醇可以很好的浸潤固定相,使鍵合相很好的伸展,用溶劑平衡好系統后,可以采取多次進樣或者加大進樣量的方式以更快的獲得重現的色譜圖,這樣用樣品將色譜柱中的活化點飽和,就不會出現異常色譜現象的情況。


      53.C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環境中,會對柱子有什么損壞嗎?pH2左右。

      答:pH=2左右容易使鍵合在硅膠基質上的固定相水解流失,包括:C18和封尾試劑的水解,封尾試劑相對更容易水解。不知道你保存的酸性環境是不是含有緩沖鹽,如果,不含緩沖鹽,只是短期幾天保存在酸性流動相中,也不必過份擔心,最多相當于這幾天一直在使用這根色譜柱,因此減少幾天的使用壽命吧;有緩沖鹽就麻煩一點,保存期間水分揮發可能會導致緩沖鹽結晶在柱內析出,對柱子損傷很大。


      54.色譜柱的安裝有什么技巧嗎?只要保證不漏就行了嗎?還有所謂的死體積怎么測定呢?

      答:色譜柱安裝技巧不多,只要接頭和柱頭匹配,確實擰緊不漏就可以了,但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是完全不保留的物質出峰時從進樣到流過色譜柱的總體積,一般用極性非常強的尿嘧啶的出峰來測定。死體積包括柱體積(色譜柱內溶劑能占據的空腔體積)和柱外體積兩部分。

      你從廠商這里買到色譜柱,柱體積已經是固定了,你能盡量避免減少的是柱外體積。進樣器內死體積、毛細管長度、毛細管和色譜柱連接緊湊與否,保護柱或在線濾器產生的死體積大小,都對這個有影響。樣品在柱內,除擴散外,還有和填料作用引起的組分分離;但樣品在柱外,那就只有擴散這個使柱效下降的因素了。所以,要取得好的分離效率,柱外體積應該是越小越好。

      峰有時候前延,有時候拖尾,一般不是色譜柱的問題,應該是樣品和色譜柱填料的作用問題,可以說如果色譜柱類型選擇沒問題,關鍵就是色譜條件的選擇。包括進樣量、樣品溶劑、流動相組成(包括:添加劑)、流動相pH以及柱溫,都對峰形有影響。另外,測定分子量較大的多肽,用樣品老化平衡色譜柱很重要,分子量越大的物質,需要平衡時間越長。如果柱子沒平衡好,峰形也可能會不正常。所以最好把你具體的測定條件也列一下,也便于有針對性的分析原因。


      55.測定多肽樣品時,十幾肽或者二十幾肽時,有時峰前延的比較厲害,有時峰拖尾比較厲害,這是什么原因呢?是樣品的問題還是柱子的問題?

      答:峰有時候前延,有時候拖尾,一般不是色譜柱的問題,應該是樣品和色譜柱填料的作用問題,可以說如果色譜柱類型選擇沒問題,關鍵就是色譜條件的選擇,包括:進樣量、樣品溶劑、流動相組成(包括:添加劑)、流動相pH以及柱溫,都對峰形有影響,另外,測定分子量較大的多肽,用樣品老化平衡色譜柱很重要,分子量越大的物質,需要平衡時間越長。如果柱子沒平衡好,峰形也可能會不正常。所以最好把你具體的測定條件也列一下,也便于有針對性的分析原因。


      56.柱子的平衡時間跟填料關系大嗎?哪種最快,哪種最慢?因為我在做離子交換柱的時候平衡是相當的慢!

      答:根據色譜速率理論,粒徑越小,柱效越高,而且當粒徑小到亞2微米左右時,線速度的提高,其分離度就不再降低,從而,改變了許久以來人們不得不在 “速度和分離度之間取舍”的局面。


      57.關于配置流動相,有機相我們可以甲醇乙腈同時用,這個是基于什么考慮的?是不是根據甲醇乙腈選擇性不同、樣品在這個兩者的溶解度的差異以及調節洗流動相脫能力來考慮的?

      答:甲醇和乙腈同時用,可以獲得單純的甲醇或者乙腈不一樣的選擇性,而且洗脫能力也會改變,根據多元流動相的強度因素Sab.....=Saψa+Sbψb=...Sa和Sb純溶劑a和b的溶劑強度因素;ψa、ψb分別為a和b的體積分數,所以,在藥典中有很多體系都使用甲醇乙腈體系。


      58.三乙胺磷酸鹽緩沖液作流動相,柱壓一天比一天高,該怎么樣解決?

      答:把柱子再生下,再生的方法搜一下有很多反沖對絕大部分色譜柱都是可行的,效果不錯。


      59.新出廠液相色譜柱,保護溶劑一般是什么?怎樣進行平衡清洗比較好,一般要平衡多長時間比較好?

      答:柱子類型不同,保存溶劑也會不一樣吧,具體要看說明書的說明。對于反相柱,一般用甲醇(乙腈)保存,也有用80%左右甲醇濃度的甲醇/水保存的。一般用流動相平衡沖洗10~20個柱體積即可。(注意:柱體積不等于空柱管體積,4.6×250mm的色譜柱空柱管體積是4.15mL,而柱體積只有約2.5mL)


      60.據說液相色譜柱柱壓達到一定高度就不能使用了,請問一般達到多高,用甲醇和乙腈是不是不一樣?

      答:柱壓不是色譜柱不能使用的唯一因素,分離度才是最重要的。柱壓只要沒高到儀器不能承受的地步,例如,超過300bar,就可以一直使用。甲醇的粘度比乙腈高,同樣狀況的柱子,如果用甲醇做流動相,柱壓可能超了,換用乙腈會使柱壓下降不少,儀器還能承受。不過盡管柱壓還沒上升到接近400Bar的限定,如果,發現柱壓上升速度較快,也需要及早對柱子進行清洗維護,從根本上排除導致柱壓上升的源頭。


      61.柱塞板可不可拆下用超聲波清洗,會有什么不良后果?

      答:不建議將柱篩板拆下清洗,因為,拆下承壓的柱篩板會導致柱床發生變化,影響色譜性能。應該對污染的色譜柱先進行清洗維護,維護沒有效果,再把拆洗柱篩板作為最后的手段。


      62.一般正常使用一個C18柱能用多長時間?

      答:柱壽命一般不按時間計算,按持續進樣針數比較科學。一般正常使用維護,不超過pH和溫度等范圍,C18柱能達到500~2000針進樣的壽命,視樣品干凈程度的不同而不同。


      63.超高壓快速高分離度色譜柱是不是未來液相色譜柱普及應用的一個發展趨勢?

      答:這是個大話題,今后使用,會越來越多是肯定的,但是否會替代普通壓力的液相還有爭議。超高壓也有使用上的不便,譬如容易堵,對設備硬件要求高等。有機會我再談談超高壓液相色譜方面詳細的一些情況。


      64.如果液相色譜譜圖基線漂移很大是不是柱子的問題?波長越小的越大,270nm的還不怎么能看出來,230nm的就非常厲害了,有可能是什么原因造成的?

      答:有可能是你的流動相的問題,230可能已經快到你流動相的截止波長了,當然,紫外吸收強,基線漂移厲害。


      65.我們有一臺waters1525色譜儀,最近基線總是呈現波浪形很有規律,波長越小越明顯,梯度洗脫時向上飄逸而且后一段時間呈現波浪形,很影響分析,我想問一下,是不是柱子的原因,用的是C18上海安普的?

      答:應該是流動相組成變引起吸收本底變化造成的,特別是在波長小的時候,乙腈的截止波長低于200nm,但甲醇和水相對比較高,在低波長時,甲醇和水有一定的本底吸收。梯度進行時,隨著不同本底的組分含量的變化,基線也會有相應的波動。

       

      66.我是做農藥殘留分析的,用的是UV2487檢測器,想問一下,C18色譜柱用什么緩沖液比較好,我以前做三聚氰胺是用檸檬酸,辛烷磺酸鈉,也用農藥檢測行不行?還有用HLB柱能不能去除蔬菜和水果中的雜質?

      答:C18色譜柱用用磷酸鹽,醋酸鹽就比較好啊,離子對試劑不是個好東東,你要慎用。我們做三聚氰胺用三氯乙酸。


      67.液相色譜柱一般使用壽命多長?不同類型的色譜柱是否壽命也不一樣?液相色譜柱與氣相的柱子有何區別呢?

      答:液相色譜柱一般使用壽命多長!我有一根柱子,用了大約1年半左右,發現同樣濃度的樣品它的峰展寬了。說明柱效下降。但是不影響結果。因為峰面積還是接近。所以做色譜之前先做下柱子性能測試。第一次的圖譜要保留。 測試C18RP柱,一般用到萘作為柱子的柱效判斷。一般是18000片,對稱性(usp)0.95~1.05間。


      68.水相”指的是什么?純水?我們實驗室的CN基柱保存在40%的乙腈里面,這個有不良后果嗎?

      答:水相就是純水。CN基不適合保存在中等極性的溶劑中,除了可以低溫保存在極性較大的純水中外,還有可以保存在非極性溶劑如正己烷中。40%乙腈水,屬于中等極性溶劑,短期過夜保存可能問題不大,長期保存不太好,后果就是可能會發生柱床坍塌。


      69.CN基柱應該怎樣維護才好呢?比如,做完實驗用什么流動相沖柱子、短期用什么溶劑保存、長期用什么溶劑保存等。

      答:CN可作正相柱,也可作反相柱用,除了保存溶劑有特殊要求外,其它維護辦法和一般正相和反相柱沒有多大區別。


      70.我們是waters的分析儀,用其他家的柱子可不可以?

      答:你用Waters的儀器,而開始也用的是Waters柱子,如果是用不銹鋼接頭,匝扣的位置就固定了。如果用其他家的柱子,可以把固定匝扣位置的那段剪掉,換一個新的匝扣就可以重新固定匝扣位置。當然,如果你已換成peek接頭,問題就不會很大。


      71.色譜柱的接頭,出口處用的是peek接頭,請問都用peek接頭不行么,為什么?

      答:都用peek接頭我認為都可以的,當然,peek接頭的質量要過關。有人認為peek接頭不耐壓,估計是針對品質不好的產品說的。


      72.我們的液相,為了節約成本我們自己填保護柱,用廢的同型號柱子填。但填完以后做標樣定量分析有所改變。請問其原因。

      答:不建議自己填保護柱柱芯,填得不好的柱芯會影響分離效果,也會影響定量分析結果。你不知道廢柱子里的填料是不是受了污染,另外你填的柱芯肯定沒有廠商填得好,如果影響到峰形,峰面積積分結果有所改變是可能的。

       

      73.請問怎么測柱效?(柱子填料是Sino Chrom ODS-BP 5μm,規格4.6mm×200mm)

      答:測定柱效不同公司不一樣,有用甲苯,也有用萘的。一般柱子里面有檢測報告,你按照報告里的方法做一遍就可以。


      74.我用苯試了一下,峰性大大好,但是,不知道理論塔板數,不知道怎么評價,感覺不大好,對稱性不好,有點前延,柱子才用了四個月,是什么原因呢?是不是塌陷了呢?有什么補救的辦法嗎?

      答:用了四個月峰形拖尾是很正常的,需要維護清洗一下色譜柱以清除引起拖尾的柱頭污染。如果柱頭塌陷,則不好辦,從其它廢柱子里取點填料填補塌陷,可以一試,但效果不一定好。色譜柱是耗材,測定進樣針數如果達到500以上了,也算是物有所值,物盡其用了,報廢了也不可惜。


      75.流動相里之前有酸的,做完后單純用乙腈沖洗,能把酸沖洗干凈嗎?之前,他們是這樣沖的,現在懷疑柱子塌陷了,會不會是長時間在酸性環境中造成的呢?

      答:流動相里有酸,應該先用純水或80:20的水/乙腈溶劑沖洗吧。如果,一直在酸性環境,固定相容易流失,造成保留時間前移和其它色譜性能下降。


      76.我前一段時間做三聚氰胺用C18色譜響應值很小,幾乎無法檢測,可是檢測標準就是用的C18,后來我用RP18結果響應值很好,不知道什么原因,請問這兩個柱子不都是反相色譜柱么?他倆之間有什么不同?

      答:RP18就是C18吧,不過C18柱之間也有區別,測定三聚氰胺一般要用極性比較大的水性C18柱。


      77.磺化交聯的苯乙烯-二乙烯基共聚物為填充劑的色譜柱在儲存過程未注意放在冰箱中,導致發霉后,柱效急劇下降,能何種方法將此色譜柱修復好?

      答:聚合物柱子因為不怕酸堿,就直接用強酸強堿清洗。如果是H型,用1M硫酸沖洗;如果是Ca型,可以先用1M硫酸沖洗,再用EDTA鈣鹽轉換回Ca型柱;如果是中性的聚合物反相柱,直接用1M的NaOH沖洗。


      78.我有一個標準的穩定性檢測分析方法它是建立在某一供應商的碳18柱上我知道有另一個廠家生產同樣的碳18柱但價錢是它的一半如果我更換柱子會不會影響到分析方法。。。

      答:要看這一分析方法的具體要求。如果方法中有說明“使用某一色譜柱或與其同樣的柱子,”那么,就可以使用別的柱子來替換。但要注意,不能光看一個柱子標為碳18柱,或是其宣傳等價于某某柱,就認為該柱適用于所有方法。必須要驗證色譜柱的等價性。

      我們需要考查使用新柱子時,系統適應性是否可以通過驗證。如果可以獲得系統適用性測試中所要求的保留值,分離度以及其它參數等,就可以使用該柱。推薦使用系統適用性測試樣品以及其它的典型樣品來進行考查,以保證雜質和降解物在正確的保留時間出峰并給出正確的濃度響應;并且在新柱子上獲得的分析結果要等價于在原柱子上的結果。


      79.請問我做一種藥的分析查美國藥典規定使用100mm×40mm,8μm的色譜柱流速3mL/min可現在市場上已不容易找到這種規格的產品于是我按USP中色譜柱比較的數據庫的指引選了一款選擇性一致的等價色譜柱其規格是100mm×46mm,3μm的色譜柱當選用3mL/min的流速時發現柱壓超高請問我如何對方法進行調整以滿足USP的要求?

      答:流速調整原則是流動相通過柱子的線速度一致,等價柱的截面積大了,流速也應增加才能保持相同的線速度。新流速計算結果是:(4.6/4.0)2×3.0=4.0mL/min。但3mL/min流速都已導致柱壓太高,4.0mL/min明顯不行。好在USP還有個允許±50%的流速調整指導原則,這樣將流速調至2.0mL/min既符合USP規定,又能使柱壓降到可接受的范圍,但這種改變不能引起其它不好后果。

      這個例子中,等度分析中,流速改變會引起塔板數和峰寬的改變,但不會影響峰的選擇性。3μm粒徑色譜柱柱效比8μm的高很多,可考慮縮短柱長以補償或部分補償流速降低造成的測定時間增加。所以,更佳選擇是50mm×4.6mm,3μm的柱子,2.0ml/min的流速運行,可以在符合USP規定的情況下,又得到更快速的測定分離。


      80.最近我非常的沮喪,按照藥典上的色譜條件和方法做某藥物的分析,卻始終得不到滿意的結果。有人建議我對色譜條件,如進樣量、流動相pH和溫度等,進行微調以得到良好的峰形和分離效果,可按公司規定我不能這樣做,怎么辦?

      答:如果你心里老有這個思維定勢“按規定,我不能......”,然后什么也不敢做,那真是不好辦!只有去做了,去試著改變條件看看得到什么結果,你才能發現問題所在。如果改變條件后,仍得不到好結果,就要去找色譜條件以外的原因,如,色譜柱、色譜儀器以及樣品和制樣過程中的是否存在問題?不管通過微調你是否取得了好結果,你也有了向領導匯報問題和解決方案的依據。

      而且,絕對不能調整藥典規定色譜條件的說法通常是不對的。美國藥典USP說的是如果改變藥典方法需要重新做方法驗證,但方法調整或者稱微調以符合系統適應性的要求是允許的,是不需要重新做方法驗證的。USP列了調整的幾條指導原則,如,±50%的流速調整,±10°C的溫度調節等等(詳見"Chapter621,Chromatography,”,UnitedStates Pharmacopeia No.31-NF 26,(2008).)。當然既然是指導原則,這些規定都不是絕對的,如溫度調整±10°C,對有些方法適用,對另外的方法則±5°C的調整都會有問題,我們應該依據具體情況作出明智的科學判斷。


      81.請問下HibarRT250-4這個柱子很特殊么?為什么很多藥典中的藥物分離都用它做柱子,因為才開始做藥,不知道hi,bar的柱子特點是什么?

      答:HibarRT250-4是Merk的一個品牌,不是很了解。大概是共用柱頭,可更換的柱管。


      82.在堿性條件下硅膠溶解,又生成硅羥基的機理是什么?反應方程式如何寫?

      答:二氧化硅溶解的反應式是:

      SiO2+2OH-=Si032-+H2O或者表示成水解的形式:SiO2+H2O=Si032-+2H+
      這說明硅膠會在堿性條件下溶解而生成硅酸根,但,我們這里說的是硅膠顆粒表面的部分溶解,含有鍵合固定相的硅膠原表面溶解脫落后,自然會生成新鮮的硅膠表面,而新鮮的硅膠表面結構一般都是含有硅羥基的。硅膠基本結構單元是Si-O-Si鍵,在OH-離子的作用下,Si-O鍵斷裂,在表面形成Si-O-H硅羥基的結構單元。

      必須指出的是,在氨基柱的孔內,并沒有單獨加入OH-離子,偏堿小環境的形成是由于氨基易和水電離生成的氫陽離子結合造成的游離OH-離子的過剩。從第一個方程式角度解釋,游離的OH-離子用完,硅膠就不再繼續溶解;從第二個水解形式方程式角度解釋:當硅膠水解生成的H+離子足夠用來和氨基結合時,水解過程就會變慢或停止。


      83.同樣都是C18柱子,液相色譜柱和SPE他們之間有什么區別,能具體講一下么?

      答:HPLC柱子和SPE小柱的對比:
      對比項目            HPLC            SPE
      柱管                 不銹鋼管        塑料管
      粒徑(um)       3,5,10          40-300
      顆粒形狀            球形          一般為無定形
      柱效(塔板數)   20-25000           <100
      分離機理          連續洗脫   數字式開關洗脫
      售價(元)       1000-4000          10-40
      使用方式          可重復使用       一次性使用
      操作成本          較高                    低
      設備成本           高                      低
      對于C18固定相,為了提高回收率,SPE里用的C18填料一般載碳量相對更高。


      84.我從上面了解到RP18C18的區別是極性強一些,能問一下他們在分析農藥是可不可以通用?C18適用于那些農藥的分析?我查材料看到苯醚甲環唑都是用C18分析的,可我用C18分析發現響應值很小,沒法分析能幫忙分析一下原因么?

      答:RP18和普通C18,肯定有其不同的適應性,農藥種類這么多,可能大部分農藥兩者都能用,有些就不一定。你問的C18適用于哪些農藥,應該從相關農藥分析方面的書籍手冊中可以查到具體什么農藥用什么色譜條件合適,其中里面肯定有選擇什么類型柱子,我這邊沒辦法一一列舉。液相色譜中,60%以上的分析物可以用C18柱,我想也應該有60%以上的農藥可以用C18柱。

      如果手冊或文獻中查不到,你把農藥作為普通分析物來對待,然后按照一般的色譜柱選擇和方法建立原則來做就可以,選擇決定因素應該也是農藥分子的結構。苯醚甲環唑,應該含有極性基團,可以試試極性強的C18柱。


      85.我在用乙腈作流動相時,只要那個乙腈比例稍高一點,比如,20%,即使,測量波長高于乙腈截止波長比較多,也會產生比較大的溶劑峰,這怎么回事?

      答:如果出現溶劑峰,對你的分析結果沒任何影響,那就讓溶劑峰在那兒好了,或者你用規定的溶劑溶解提取樣品后,再用流動相稀釋一下樣品,如果,稀釋后檢測限能達到的話。


      86.我在做一個模擬胃內容物中藥物反應試驗,需要動態測定某藥品含量變化。分析時碰到一個棘手問題,進樣量同樣用20μL,用對照品進樣時色譜峰形不錯,進樣品時卻一直不能得到好的峰形。后來分析是模擬胃內容物樣品的酸度過高的因素,可我通過稀釋的方法讓樣品酸度和流動相接近,雖然峰形沒問題了,卻發現因稀釋導致分析物在樣品中含量下降,低于最低檢測限了,如何是好呢?

      答:稀釋很方便,但靈敏度更高的檢測器不容易找,不過還是有個簡單的解決方案。當用流動相稀釋樣品時,只要稀釋后樣品中有機相含量比流動相中的有機相比例低10個百分點以上(如,流動相中甲醇含量是40%,則樣品中甲醇含量一定要低于30%),樣品流動會被色譜柱進口端延緩或阻擋,稱為“柱上富集”。由于“柱上富集”作用的存在,這種情況下進行大體積樣品進樣,可避免樣品溶劑組成和流動相一樣時進樣量過大產生的“峰展寬”。針對你提的這個實例,可用稀的NaOH溶液調節樣品pH和流動相匹配,并將樣品最終稀釋一倍。將進樣量提高一倍到40μL,就可達到最低檢測限的要求。


      87.峰形后拖尾是什么原因造成的?

      答:

      [柱物理損壞]

      色譜柱有物理損壞是造成峰形拖尾的根源。唯一的解決方法就是更換新柱。


      [柱內填料污染]
      流動相和樣品中的雜質是色譜柱主要污染源。
      流動相所用的各種溶劑至少是分析純,盡量使用色譜純試劑。流動相所用的水最好是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45μm溶劑微孔過濾(器)過濾,除去可能存在的微粒。流動相建議現用現配,對于含鹽的溶液尤其注意長置會產生細菌或出現沉淀。此外還得保證儲存流動相的容器清潔。
       復雜樣品可選用0.45μm溶劑微孔過濾(器)或樣品預處理柱對樣品進行預處理,確保樣品中不含微粒雜質。若樣品不便處理,要使用保護柱。柱內填料污染時,可將柱頭螺絲卸下,用專用工具挖出柱內前段被污染填料,再以相同的填料重新填入,修復,或以能溶解污染物的流動相按色譜柱使用的相反方向,沖洗色譜柱(約20至30倍柱體積,或視具體情況而定;另外,此時不能接檢測器),將污染物沖出色譜柱,再按色譜柱標明的使用方向使用。


      [柱進口處有異物]
       當斷定是柱進口處有異物時,可將柱頭螺絲卸下,取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中,用超聲波清洗約20分鐘,再置于超純水中,并用超聲波清洗約10分鐘,重新裝入色譜柱內即可。


      [樣品濃度過高致使柱超載]
      樣品在柱上超載能引起峰展寬,拖尾(或伸舌)。
      適當減小進樣量或樣品濃度(需要時,可提高檢測器靈敏度)直至峰形和保留時間不再改變,便可消除這種不良影響。減小進樣量還能改善其分離度。正常情況下,樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進樣量保持在3~50μg范圍內,不會引起明顯超載。


      [樣品溶劑不對]
      選擇合適的樣品溶劑,以排除不必要的干擾,最好選用流動相溶解樣品。


      [柱外效應]
      柱外效應(即進樣閥、色譜柱及檢測器間的管路過長、直徑過粗、管路接頭不匹配、有死體積)是影響色譜柱柱效的主要因素之一,所以,在可能的條件下,色譜柱的兩端連接管路要盡可能短,連接管內徑盡可能細小,切口務必平整光滑,盡可能的減小死體積,以防止因樣品擴散造成不能反映色譜柱真實柱效等情況發生。


      [緩沖不足或不合適]
      在緩沖不好或離子強度過低的分離中,也會出現保留時間重現性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度(與樣品大小相匹配)能改善此情況。


      [硅醇基團作用]
      仔細分析色譜柱內填料表面性質可知:反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半,其余的就是未被鍵合的硅醇基團。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結果。但是,酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團或金屬雜質之間相互作用而引起雙重保留機理,因此,發生了峰形拖尾。

      為了減小峰形拖尾,通?稍诹鲃酉嗉尤25mM三乙胺(抑制劑)。三乙胺能與硅醇基團發生強烈的相互作用,從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團的作用,以保證保留機理正常進行,并大大緩解了峰形拖尾。使用長鏈的硅醇基抑制劑,雖起效較慢,但,持續力較三乙胺長。因為抑制劑分子中除了胺基與硅醇基團發生極性作用外,大分子中非極性部分與固定相也會發生反相作用而產生保留現象。如果,將抑制劑加至樣品中,效果會顯著。


      [柱內金屬污染]

      柱內金屬污染(Fe,Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進,也可由腐蝕性流動相緩慢溶解柱進口的金屬濾片,隨流動相沉積到柱填料中,例如,C18柱填料被金屬污染后,造成酸性/堿性樣品拖尾,可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料,得到的峰是尖銳且對稱的。


      88.流動相與柱子如何才能做到匹配,達到最好的分離效果。目前我們實驗室有購買好的色譜柱,可是對樣品的分離效果不是很好。

      答:不同填料的色譜柱都有自己的選擇性,相同填料不同廠家以及相同廠家不同品牌之間的選擇性都是不一樣的,一般情況下根據物質的性質將分離的大方向如:正相分析或者反相分析,確定后,一般可以根據調節色譜條件能得到好的色譜峰形,這方面的資料論壇當中很多,但是也有些色譜柱不管怎么調整色譜條件都不行,表面這款色譜柱的選擇性不適合該樣品的選擇。


      89.我用的是C18柱,后面黑色的是我以前跑的圖,前面是我現在跑的圖形,完全一樣的東西,只是流動相不是一批配的(流動相的成分沒變),中間柱子別人用過了,峰型怎么發生了這么大的變化?可能的原因是什么?是不是柱子出了問題?

      答:從兩個圖對比很明顯可以看出是柱效嚴重下降,且伴有肩峰。不同時間配的流動相,如果成分和pH沒變的話,肯定不會造成這個結果。估計是別人用柱子過程中,造成了柱頭塌陷、柱頭污染以及固定相流失等嚴重問題,如樣品太臟,流動相或樣品pH太高或太低,都會造成這個結果。

      你可以試著用色譜柱清洗和再生的方法反沖維護一下,但不能保證一定能回到原來的效果。再生如果不行,考慮挖補柱頭填料,實在不行,柱子也只能報廢。建議柱子最好還是專門用于一種方法比較好,像你這種情況,都搞不清別人怎么用柱子的,分析解決問題就相當難。


      90.柱子的柱效影響大嗎?一般柱子的柱效規定是多少的呀!理論塔板數一般要達到多少呢?主要有那些因素影響它。

      答:柱效是柱子性能好壞的一個重要體現指標。柱效會影響分離度,當然是峰形越尖銳,柱效越高,和其它峰越容易分開。另外柱效高峰形尖銳,對峰面積的積分誤差就小,甚至可以用峰高來定量。

      一般C18柱,在測定甲苯等不易拖尾的小分子中性不電離物質時,5μm的填料,每米的柱效能達到80000以上的塔板數,就算合格吧。在實際分析物的測定時,一般藥典有規定最低柱效是2000~3000,一般新柱子的柱效都高于這個數。但柱子在使用后,由于固定相流失等原因,柱效會逐步下降,當下降到不符合藥典最低柱效要求,或者導致分離度不夠時,色譜柱就算壽命到了。單從柱效逐步下降這個角度看,柱效高的色譜柱相對使用壽命更長。

      影響柱效的因素有粒徑、粒徑和孔徑分布、固定相鍵合密度、柱外體積和溫度等,柱子裝填緊密、柱床均勻一致也對提高柱效有好處。這些影響因素中,很多是和生產廠商有關,你這邊能做的是盡量減少柱外連接體積。


      91.流動相中加入四氫呋喃對柱子有損害嗎?我現在分析一樣品流動相中用到20%的四氫呋喃才能把峰分到基線.但柱子只能用一個星期分離效果就不好了.請問是四氫呋喃損壞了柱子嗎?

      答:四氫呋喃(THF)是反相色譜中洗脫能力極強的溶劑,比甲醇和乙腈都強很多。在流動相中加入THF能改善某些難分離的物質對的分離度,但,THF不穩定,容易降解生成具有很強反應活性的過氧化物,能與分析物反應生成新化合物,導致拖尾、峰分裂和鬼峰產生。高反應活性的過氧化物還可以和填料固定相發生化學作用,THF對柱子有損傷這點是無疑的,而且這種損傷是隨時間累積的。THF保質期一般規定是6個月,放得越久,里面產生的過氧化物含量越大,你應該避免使用生產日期已很久的THF溶劑,而且最好將THF冷藏、干燥和避光保存,使用前最好能檢測一下過氧化物的含量。


      92.在用液相色譜同時分離多種組分時,怎么通過條件色譜條件使各個峰達到比較理想的分離效果!

      答:這是方法開發的大問題。方法開發建立,要做的就是:針對分析物和基體的情況不同,選擇色譜柱類型和分析條件,包括流動相溶劑類型、組成比例、pH值、溫度和流速等參數的確定。這方面的問題,要講起來內容非常多。


      93.是樣品過載問題,按藥典檢測方法檢驗一些藥品有關物質時,都要注入高濃度的供試液,這樣往往使得柱過載而峰變形,按老師的方法減小濃度和注入量均是不允許的,怎么處理這問題?

      答:藥典方法中注入高濃度供試液測定有關物質,提高注入濃度是為了把雜質峰的信號增強。有時候為了把雜質峰顯現出來,主峰因過載有所變形,如在允許范圍內,也能接受。但前提是雜質峰和樣品主峰分開,如果因過載而使兩峰沒有得到需要的分離度,雜質峰信號再強也失去了意義。我認為藥典規定的條件是允許在一定范圍內進行調節的,因為藥典沒有規定具體使用色譜柱的品牌,而不同品牌的柱子,上樣量是有差異的。對色譜條件微調,并取得到了很好的分析結果,如果規定不允許,那你首先要懷疑這個規定是否合理,或者是否對規定的理解有問題。


      94.哪些原因會造成色譜峰變寬、峰高變低,有哪些解決辦法?

      答:確實是這樣,如果其它色譜條件沒有改變,柱效下降是導致峰變寬的主要原因。對于易電離的極性物質,如果流動相pH選擇不合適,分析物既有中性分子態存在,又有離子態存在,峰也會變寬變矮。

      色譜柱使用后柱效逐步下降是正,F象,如突然降低則屬異常。柱效下降原因有很多,但柱效快速下降則多半是使用不當,造成填料特性或柱床結構改變所致。如超過使用pH范圍造成的固定相和硅膠基體的流失、柱床塌陷等;還有強保留物質吸附在填料表面,形成非特異性吸附層,完全改變了原有固定相的表面活性和分離性能,使柱效下降;另外進樣時的壓力脈沖,也會破壞柱床結構影響柱效。


      95.我以前做蘇丹紅用的是安捷倫的SB-C18柱,峰形什么都很好,最近發現4個標樣峰后都帶有一個小峰,一開始以為是標樣問題,后來換XDB-C18后標樣又正常了?墒怯SB-C18柱做其他用正常,不知怎么回事?還有,像這種C18柱如果壓力過高能不能反沖,該如何沖洗?一般做獸殘、農殘什么的,而且感覺三聚氰胺做后壓力更易增高,且容易引發進樣器漏等問題,請問做完三聚氰胺需對系統做特殊清洗嗎?

      答:用SB柱,標樣后帶一小峰,而且是只對蘇丹紅標樣測定時有,估計和蘇丹紅標樣的測定方法和其它樣品測定方法不同有關。最好能把譜圖貼上來看看,是什么樣的小峰?才能判斷是溶劑峰還是雜質峰。XDB柱和SB柱是有區別的,XDB鍵合度高,封尾良好,反相保留能力強;而SB柱,未進行封尾,對極性物質選擇性好。有可能你的蘇丹紅標樣分解了,有極性雜質生成,SB柱能把雜質分開,而XDB柱不能。

      這兩款柱子壓力大了,可以反沖。有正常維護時的反沖沖洗和再生時的強溶劑沖洗兩種,沖洗方法在在線講座里也寫了,你再回到本貼的前面看看就可以了。

      三聚氰胺和三乙胺類似,本身容易和硅醇基作用而吸附在填料表面,另外三聚氰胺測定的樣品基體含蛋白類的強保留物質較多,容易污染色譜柱柱頭引起填料間隙堵塞柱壓升高,最好每次做完樣后,都用甲醇或乙腈反向清洗維護一下。如有蛋白類的污染,也定時用本講座中提到的清洗方法做一下維護。


      96.我是做農藥殘留分析的,不同的基質雜質含海量是不同的,我用C18分析時有可能一次就污染了,我用高流速,和反向沖洗都解決不了,是不是這根柱子就廢了,有沒有其他的辦法?

      答:高流速反向沖洗是對的,關鍵你用了什么溶劑沖洗呢?用原來的流動相沖洗肯定不管用,要不然就不會累積在柱子上了。你應該用流動相中的強溶劑B沖洗,如果不行,就需要啟用再生的程序,當然再生時用的溶劑更強。

      100%甲醇——100%乙晴——75%乙晴/25%異丙醇——100%異丙醇——100%二氯甲烷——100%正己烷。
      用每種溶劑沖洗至少10個柱體積,對于250mm×4.6mm的分析柱,合適的沖洗流速是1~2mL/min。最后,用10柱體積的異丙醇過渡,然后回到原來的流動相體系。

      再生還不解決問題,最后一招就是挖補柱頭填料,把柱頭污染的填料挖掉,用干凈填料填補進去。挖補填料,破壞原有柱床結構,挖補后柱效也不可能有新柱水平,或許能再維持一段時間,但不會長久。


      97.還有溶劑中的金屬過濾頭生銹了,會有什么影響?會不會影響到柱子的壽命,金屬離子和柱子有沒有什么反應?

      答:我覺得你就把銹當成顆粒物污染的一種,會導致拖尾、柱壓上升等。溶解的金屬離子一般在反相柱上沒有什么保留能力,馬上就會被沖出柱子,不會和固定相或者和硅膠基質反應。


      98.如果在溶劑過濾時把水膜當成有機膜了溶解了而且這樣的溶劑又做有機相用了,造成C18柱壓由1000升到3000,流動相是乙腈和水,問一下這樣的柱子還能用么?有沒有什么補救方法?

      答:溶解的膜作為了顆粒物堵塞篩板,引起柱壓上升,也只有反沖一下,如果能把堵在篩板上的膜殘渣沖走,柱壓下降了就OK了;如果,殘渣進入了柱子內部的填料間隙,會難沖一點,也只能多沖一會吧,實在不行,你又舍不得把色譜柱報廢,就只有挖補柱頭填料和換篩板了。


      99.保護柱和預柱的作用是不是一樣的,如果不一樣有什么區別么?保留時間漂移多少為可以接受的范圍?

      答:保護柱一般帶填料,相當于一根縮短了的色譜柱(一般是1~2cm長度),卡套里可更換的柱芯,柱管、篩板和填料都有。保護柱里的柱芯好像是在前面開路的掃雷部隊,流動相和樣品里如有什么損害柱子的污染物,保護柱就自己承受了下來。

      而預柱,現在一般指的就是接在進樣器和色譜柱之前的在線過濾器。在線過濾器和保護柱的最大區別是不帶填料,只有可更換的篩板。預柱只能保護色譜柱免受顆粒物質的污染,而不能阻擋溶解在流動相中的強保留物質。

      保留時間是液相色譜中一個很有用的診斷分離問題的工具。保留時間受流動相組成、溫度、pH、流速、固定相流失和柱老化等很多因素的影響,如果所有這些參數保持不變,保留時間也保持恒定。但在實際操作中,不可能對每個色譜參數進行很完美的控制,如即便加了柱溫箱,溫度還是會有波動;流動相組成會因組分揮發性不同而改變。

      所以,保留時間有上下0.02~0.05min的變動是非常正常的,對某些方法有0.1min上下變動也屬正常。保留時間有大的變化,預示著系統和方法存在問題。流路里有氣泡存在,泵閥有泄漏,會因流量降低而導致保留時間增加。梯度混合比例閥故障也是保留時間變化原因之一。


      100.液相色譜柱與氣相的柱子有何區別呢?

      答:HPLC是走液體的。分正相,反相。反相為例。Si接著C18(鍵和相),電鏡下看起來像絨毛一樣的。所以一般用甲醇,乙腈保護RP柱。這樣它的絨毛呈舒展狀。GC走氣體的。固定相涂布固定液。 
      編輯:songjiajie2010

       
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      關鍵詞: 色譜柱
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