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      食品伙伴網服務號

      沙門氏菌及檢驗

      放大字體  縮小字體 發布日期:2010-09-01  瀏覽次數:18331
      核心提示:  人沙門氏菌病有四類綜合癥:沙門氏菌;傷寒;非傷寒型沙門氏菌敗血癥和無癥狀帶菌者。沙門氏菌胃腸炎是由除傷寒沙門氏菌外

        人沙門氏菌病有四類綜合癥:沙門氏菌;傷寒;非傷寒型沙門氏菌敗血癥和無癥狀帶菌者。沙門氏菌胃腸炎是由除傷寒沙門氏菌外任何一型沙門氏菌而所致,通常表現為輕度,持久性腹瀉。傷寒實際上是由傷寒沙門氏菌所致。未接受過治療的病人致死率可超過10%,而對經過適當醫療的病人其致死率低于1%,幸存者可變成慢性無癥狀沙門氏菌攜帶者。這些無癥狀攜帶者不顯示發病癥狀仍能將微生物傳染給其他人(傳統的例子就是瑪麗傷寒)。

        非傷寒型沙門氏菌敗血癥可由各型沙門氏菌感染所致,能影響所有器官,有時還引起死亡。幸存者可變成慢性無癥狀沙門氏菌攜帶者。

      一、致病性

        沙門氏菌胃腸炎,潛伏期一般6-72小時,主要癥狀為惡心、嘔吐、腹絞痛、腹瀉、發熱寒顫頭痛。病程一般1-2天或更長。感染劑量為15-20個菌,死亡率達1-4%。最易感群體是年幼兒童、虛弱者、年長老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的糞便,沙門氏菌常存在于動物中,特別是禽類和豬。在許多環境中也有存在。從水,土壤,昆蟲中,從工廠和廚房設施的表面和動物糞便中已發現該類細菌。它們可以存在于多類食品中,包括生肉,禽,奶制品和蛋,魚,蝦和田雞腿,酵母,椰子,醬油和沙拉調料,蛋糕粉,奶油夾心甜點,頂端配料,干明膠,花生露,橙汁,可可和巧克力。

        沙門氏菌屬也是嗜溫性細菌,在中等溫度,中性pH,低鹽和高水活度條件下生長最佳。生長最低水活度為0.94。兼性厭氧,對中等加熱敏感。同樣,該菌屬能適應酸性環境。通過衛生以防止二次污染;蒸煮;巴氏消毒等控制。正常家庭烹調,個人衛生可以防止煮熟食品的二次污染,以及控制時間和溫度一般都能充分防止沙門氏菌病的發生。

      二、檢驗

        因沙門氏菌是最常見的食源性細菌病原體,因此在本節中重點介紹沙門氏菌的檢驗。沙門氏菌是食物傳播病原菌中研究最活躍的細菌。從食品中分離和鑒定沙門氏菌,當前通用的方法學分5個步驟:

        1.前增菌-第一步使食物樣品在含有營養的非選擇性培養基中增菌,使受損傷的沙門氏菌細胞恢復到穩定的生理狀態。

        2.選擇性增菌-在含選擇性抑制劑的促生長培養基中間,樣品進一步增菌的一個步驟。此培養基允許沙門氏菌持續增殖,同時阻止大多數其他細菌的增殖。

        3.選擇性平板分離-這一步采用固體選擇性培養基,抑制非沙門氏菌的生長,提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識別。

        4.生物化學篩選-排除大多數非沙門氏菌。也提供了沙門氏菌培養物菌屬的初步鑒定。

        5.血清學技術提供了培養物菌種的鑒定。

        這五個步驟代表理想狀況。不過一個有經驗的檢驗員,可能在一個或幾個步驟中看出特性和差別。

        目前檢驗食品中的沙門氏菌是按統計學取樣方案為基礎,25g食品為標準分析單位。

      三、從食品中分離沙門氏菌樣品的制備

        下面的方法是以25g樣品為檢測單位,樣品:肉湯為1∶9的比例。除非另有說明,根據混合程度,加足夠的肉湯保持1∶9的比例。對不需準確稱量檢測的樣品,例如:田雞腿,可參看特定方法說明。

      1、干蛋黃、干蛋白、干全蛋、液奶(去脂牛奶,含2%脂肪牛奶,全脂奶,和脫脂奶)、粉狀調制食品(蛋糕,甜餅,炸面圈,餅干和面包)、嬰兒食品、口食或軟管進食含蛋的食品:

        檢驗前的冷凍樣品最好不要解凍。如果冷凍樣品必須軟化以獲取待檢測部分,則盡可能迅速的解凍所需部分,使競爭菌數少增加或降低沙門氏菌的可能損傷。解凍需在45℃以下,有自動調溫器自控的水浴鍋內不斷攪拌進行15min或在2&#0;5℃,18小時內解凍。無菌操作稱取25g樣品,放入滅菌帶螺旋帽的廣口瓶中(500mL)或其他合適的容器內。非粉狀的樣品,加入225mL滅菌乳糖肉湯。如果制品是粉狀,加入約15mL滅菌乳糖肉湯,用滅菌玻璃棒,匙或滅菌壓舌器攪拌,使成均勻懸液。再加3份乳糖肉湯10mL,10mL,190mL,使總量為225mL。充分攪拌,直到樣品完全懸浮沒有團塊為止。蓋緊瓶蓋在室溫靜置60min。振搖使充分混勻,用試紙測定pH值。必要時用滅菌的1NNaOH或1NHcl調節pH至6.8±0.2。在測定最終pH前要蓋緊瓶蓋并充分混勻。然后將瓶蓋旋松約1/4圈,置35℃培養24±2小時。以下步驟按四,1-10進行。

      2、蛋類:

        A、含殼蛋:用硬刷子在水流下刷洗蛋。把蛋在含0.1%十二烷酸磺酸鈉(SDS)的200ppm氯離子溶液中浸泡30min。加8mL 5.25%次氯酸鈉到含1g SDS的992mL蒸餾水中,制備200ppm cl-/0.1%SDS溶液。這種消毒劑需在使用前臨時制備。無菌操作打開蛋,使用滅菌的蛋分離器,棄去蛋白。無菌操作稱取25g蛋黃到滅菌的500mL錐型瓶或其他合適容器內。加225mL胰胳胨(胰化物)大豆肉湯(TSB),并振蕩充分混勻。在室溫下靜置60分鐘。振搖使其充分混勻,用試紙測定pH值。必要時調節pH值至6.8±0.2,置35℃培養24±2小時,以下步驟按四,1-10繼續。

        B、液全蛋(均狀):無菌操作稱25g置于無菌的500mL錐形燒瓶或其它合適容器中。加225mLTSB并振蕩充分混勻。按上面所述繼續。

        C、煮硬的蛋(雞蛋,鴨蛋或其他蛋類):目前,不知道蛋白中的沙門氏菌抑制因子是否具有熱穩定性。因此,無菌操作分離蛋白和蛋黃。稱取25g粉狀蛋黃固體到無菌500mL錐型瓶或其他合適容器中。加225mLTSB并旋轉充分混勻。按上面所述繼續。

      3、脫脂乳粉

        A、速溶:無菌操作稱取25g樣品,加入滅菌燒杯(250mL)或其它合適容器內。經滅菌玻璃或紙質(用帶卷好以備高壓滅菌)漏斗,往滅菌的500mL錐形燒瓶或其它合適容器中(裝有225mL煌綠水),緩緩傾注25g檢測單位,使其覆蓋在煌綠水表面。也可將多份25g檢驗單位按比例 倒入相應份數的煌綠水表面。按每1000mL滅菌蒸餾水中加1%煌綠溶液2mL配置煌綠水。將盛有樣品&#0;前增菌培養基的容器靜置60±5分鐘。松松地蓋上容器蓋,不需要混合或調節pH值,于35℃培養24±2小時,以下步驟按四,1-10繼續。

        B、非速溶:按上述A脫脂乳粉的方法進行,只不過不允許將多份檢驗單位按比例合并檢驗。

      4、全脂奶粉:

        無菌操作稱取25g樣品,加入無菌的,帶螺旋帽的廣口瓶中(500mL)或其他合適的容器內。加入225mL滅菌蒸餾水并振蕩充分混勻。蓋緊在室溫下靜置60分鐘。使其充分混勻,用試紙測定pH值。必要時調節pH值至6.8±0.2。在測定最終pH前要蓋緊瓶蓋并充分混勻。然后加0.45mL1%的煌綠染液并充分混勻。旋松瓶蓋約1/4轉后,置35℃培養24±2小時,以下步驟按四,1-10繼續。

      5、酪蛋白:

        無菌操作稱取25g樣品,加入無菌均質杯中,加225mL滅菌乳糖肉湯到樣品中并勻質2分鐘。無菌操作,把已勻質的混合物轉移到滅菌,帶螺旋帽的500mL廣口瓶或其他合適的容器內。蓋緊蓋子在室溫下靜置60分鐘。振搖使充分混勻,用試紙測定pH值。必要時調節pH值至6.8±0.2。在測定最終pH前要蓋緊瓶蓋并充分混勻。旋松瓶蓋約1/4圈后,置35℃培養24±2小時,以下步驟按四,1-10繼續。

      6、大豆粉:

        無菌操作稱取25g樣品,加入滅菌燒杯(250mL)或其它合適容器內。用滅菌玻璃或紙質(用帶卷好以備高壓滅菌)漏斗,往裝有225mL乳糖肉湯的滅菌的500mL錐形燒瓶或其它合適容器中,緩緩傾注25g檢測單位,使其覆蓋在乳糖肉湯表面。檢測單位(25g)不可多份按比例混合檢測。容器靜置60±5分鐘。松松地蓋上容器蓋,不需要混合或調節pH值,于35℃培養24±2小時,以下步驟按四,1-10繼續。

      7、含蛋制品(面條,蛋卷,通心粉,意大利面條)、干酪、生面團、調制色拉(火腿,蛋,雞肉,金槍魚,火雞)、新鮮的、冷凍的、或干的水果和蔬菜、果仁、甲殼類動物(小蝦,蟹,小龍蝦,LANGOSTINOS,龍蝦)和魚:

        檢測前冷凍樣品最好不要解凍,如果冷凍樣品必須軟化以取其檢測部分,則要在持續攪拌并帶有自動調溫器控制的45℃水浴內15分鐘內解凍;蛘咴2&#0;5℃18小時內進行。

        無菌操作稱取25g樣品,加入滅菌的均質器中。加入225mL滅菌的乳糖肉湯并均質2分鐘。再無菌操作轉移已均質的混合物到無菌的帶螺旋帽的廣口瓶中(500mL)或其他合適的容器內。蓋緊瓶蓋,于在室溫下靜置60分鐘。振搖使其充分混勻,用試紙測定pH值。必要時調節pH值至6.8±0.2。充分混勻。旋松瓶蓋約1/4轉后,置35℃培養24±2小時,以下步驟按四,1-10繼續。

      8、干酵母:

        無菌操作稱取25g樣品,放入滅菌帶螺旋帽的廣口瓶中(500mL),或其他合適的容器內。加入225mL滅菌胰酪胨(胰化)大豆肉湯,充分混勻使酵母形成均勻懸液。蓋緊瓶蓋于在室溫下靜置60分鐘。振搖使其充分混勻,用試紙測定pH值。必要時,調節pH值至6.8±0.2,在測定最終pH前要混合充分。旋松瓶蓋約1/4轉后,置35℃培養24±2小時。非活性干酵母,以下步驟按D,1-11進行;钚愿山湍,混勻經培養過的樣品,轉種1mL到10mL月桂基蛋白(LST)中,另轉種1mL到10mL四磺酸鹽(TT)肉湯中。將此兩種選擇性肉湯于35℃培養24±2小時。充分地旋轉混合經培養過的增菌肉湯,每種肉湯都要用3mm接種環劃線接種3個選擇性平板(四,3和四,4),接下面的四,5&#0;10進行。

      9、食品上霜和上頂用的混合物:

        無菌操作稱取25g樣品,放入滅菌,帶螺旋帽的廣口瓶或其他合適的容器中。加入225mL營養肉湯并充分混合。蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。振搖使其充分混勻,用試紙測定pH值。必要時,調節pH值至6.8±0.2。旋松瓶蓋約1/4轉后,置35℃培養24±2小時。以下步驟按四,1-10繼續。

      10、調味品:

        A、黑胡椒、白胡椒、芹菜籽或者干辣椒粉、小茴香、紅辣椒、歐芹片、迷迷香、芝麻、麝香草、蔬菜片:無菌操作稱取25g樣品,放入滅菌帶螺旋帽的廣口瓶或其他合適的容器中。加入225mL滅菌胰酪胨大豆(TSB)肉湯,充分混勻,蓋緊瓶蓋于在室溫下靜置60分鐘。旋動混勻,用試紙測定pH值。必要時,調節pH值至6.8±0.2。旋松瓶蓋約1/4轉后,置35℃培養24±2小時。以下步驟按四,1-10繼續。

        B、洋蔥片、洋蔥粉、大蒜片:無菌操作稱取25g樣品,放入滅菌帶螺旋帽的廣口瓶或其他合適的容器中。將樣品于含K2SO3的TSB胰酪胨大豆肉湯(1000mLTSB加5g K2SO3使K2SO3的最終的濃度為0.5%)中進行前增菌。添加K2SO3于肉湯中。分裝225mL于500mL錐形瓶中,經121℃高壓滅菌15分鐘。滅菌后無菌操作測定容量,必要時再調整至225mL。將225mL含K2SO3的無菌TSB加入樣品中,充分混勻。接下去按三,10A節進行。

        C、牙買加胡椒、桂皮、丁香及薄荷:目前還沒有方法可以中和這四種香料的毒性。將香料稀釋至無毒的程度,再進行菌檢。檢驗牙買加胡椒,桂皮和薄荷時,樣品與肉湯比例為1∶100,而丁麝香樣品與肉湯比例為1∶1000。檢查葉狀的調味品,因遇到脫水的制品,可吸收肉湯這一實際困難,其樣品與肉湯比例要大于1∶10。檢查這些調味品按三,10A描述的方法進行,保持推薦的樣品與肉湯的比例。

      11、糖果與糖衣(包括巧克力):

        無菌操作稱取25g樣品放入滅菌的攪拌容器中。加入225mL滅菌的調配脫脂乳粉,攪拌2分鐘。再無菌操作轉移攪拌過的混合物到滅菌帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。轉動混勻,用試紙測定pH值。必要時調節pH值至6.8±0.2。再加入0.45mL1%煌綠染液混勻,將瓶蓋旋松1/4轉后培養。以下按四,1&#0;10節進行。

      12、椰子:

        無菌操作稱取25g樣品放入滅菌的帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。加入225mL滅菌的乳糖肉湯,振搖后,蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘,再振搖使其充分混勻,用試紙測定pH值。必要時調節pH值至6.8±0.2?傆嫾尤2.25mL已蒸過(15分鐘)的陰離子特吉托爾7號,并充分混勻?捎靡颜暨^(15分鐘)的三硝基甲苯X&#0;100來代替。這些表面活性劑限制使用最小量,使之剛剛起泡沫即可。三硝基甲苯X&#0;100大約2或3滴。旋松瓶蓋約1/4轉后,置35℃培養24±2小時。以下步驟按四,1-10繼續。

      13、食用染料與食用色素:

       pH6.0或以上的染料(10%懸浮液),按上述干全蛋方法(C&#0;1)處理。沉淀染料或pH低于6.0的染料,無菌操作稱取25g樣品,放入滅菌的帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。加入225mL不含煌綠染料的四硫磺酸鹽肉湯混勻。蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘,用pH計調節pH值至6.8±0.2。再加入2.25mL0.1%的煌綠溶液,充分旋動混勻。旋松瓶蓋約1/4轉后,置35℃培養24±2小時。接下去按下面的四,3&#0;10節進行。

      14、明膠:

        無菌操作稱取25g樣品,放入滅菌的帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。加入225mL滅菌的乳糖肉湯和5mL5%明膠酶水溶液;旌暇鶆,蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。轉動混勻,用試紙測定pH值。必要時調節pH值至6.8±0.2。將瓶蓋旋松1/4轉,置35℃培養24±2小時。以下按四,1&#0;10節進行。

      15、肉、肉代用品、肉副產品、動物產品、腺體制品和粗粉(魚,肉,骨):

        無菌操作稱取25g樣品放入滅菌的攪拌器中。加入225mL滅菌的乳糖肉湯,攪拌2分鐘。再無菌操作轉移已攪拌的混合物到滅菌的帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。如果混合物為粉狀,研磨過或已粉碎的,則不用攪拌。不需要攪拌的樣品,加入乳糖肉湯,并充分混勻;蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。旋動使充分混勻,用試紙測定pH值。必要時調節pH值至6.8±0.2?傆嫾尤2.25mL已蒸過(15分鐘)的特吉托爾陰離子7號,混勻。也可用已蒸過(15分鐘)的三硝基甲苯X&#0;100來代替?刂剖褂眠@些表面活性劑劑量,剛剛起泡沫即可。實際用量取決于試驗材料的成分;分析粉狀腺體制品,不需要用表面活性劑。將瓶蓋旋松1/4轉后,將樣品混合物置35℃培養24±2小時。以下按四,1&#0;10節進行。

      16、田雞腿(此方法用于國內的和國外的所有田雞腿檢驗):

        將15對田雞腿放入滅菌塑料袋內,并用滅菌乳糖肉湯浸沒。如果單個腿估計平均重在25g或以上,則只需檢查15對的每對中的一條腿。把袋放入大塑料燒杯內或其它合適的容器中,在機械蕩器上震蕩15min,以4cm(1-1/2in)機械振蕩100次/分鐘。從袋中傾倒出乳糖肉湯于另一個滅菌塑料袋內。加更多的乳糖肉湯,使總量為3500mL。充分混勻,于室溫下靜置60分鐘。必要時調節pH值至6.8±0.2。再把裝有乳糖肉湯的塑料袋放入塑料燒杯或其它合適的容器內,于35℃培養24±2小時。接下去按下面的四,1&#0;10節進行。

      17、野兔骨架(此方法用于國內的和國外的所有的野兔骨架):

        取3只野兔骨架放入滅菌塑料袋內,并用滅菌乳糖肉湯浸沒(見上述A,23&#0;25節),把袋放入大塑料燒杯內或其它合適的容器中,在機械震蕩器上以4cm(1-1/2in)幅度振蕩100次/分鐘,震蕩15min。從袋中傾倒出乳糖肉湯混合物于另一個滅菌塑料袋內,加更多的乳糖肉湯,使總量為3500mL。充分混勻,于室溫靜置60分鐘。必要時用pH試紙調置6.8±0.2,于35℃培養24±2小時。接下去按下面的四,1&#0;10節進行。

      18、口香糖:

        無菌操作稱取25g樣品到滅菌燒杯(250mL)或其他合適容器中。制備過濾除菌的1.0%纖維素酶溶液(加1g纖維素酶到99mL無菌水中),用0.45um膜過濾除菌,置于150mL瓶中。(纖維素酶溶液在2·-5℃可保存最長2周時間)。加入225mL無菌乳糖肉湯和2.25mL無菌1%纖維素酶溶液于500mL無菌帶螺旋蓋的廣口瓶或其他合適容器。用磁力攪拌器劇烈攪拌酶/肉湯混合物時,通過無菌玻璃漏斗迅速倒入25g待檢樣品。旋好瓶蓋,室溫下靜置60分鐘,無須調pH值。旋松瓶蓋,35℃培養24±2小時。以下按四進行。

      四、沙門氏菌的分離

        1、擰緊瓶蓋并輕輕振蕩培養過的樣品混合物。

        生鮮食物、嚴重污染的食品和動物飼料:

        轉移0.1mL混合物到10mLRAPPAPORT&#0;VASSILIADIS(RV)肉湯培養基中,另轉移1mL混合物到10mL四硫磺酸鹽肉湯(TT)中。

        其它食品:

        轉移1mL混合物到10mL亞硒酸鹽胱氨酸肉湯(SC)中,另轉移1mL混合物到10mL四硫磺酸鹽肉湯(TT)中。

        2、選擇性增菌按如下步驟進行:

        生鮮食品、嚴重污染的食品和動物飼料:

        RV培養基在42±0.2℃(水溶)中培養24±2小時。TT肉湯在43±0.2℃(水溶)中培養24±2小時。

        其它食品:

        SC和TT肉湯在35℃培養24±2小時。

        3、混合均勻(如果是試管,渦旋式混合),用3mm直徑的接種環,滿環(10μl)劃線接種TT肉湯于亞硫酸鉍(BS)瓊脂,木糖賴氨酸去氧膽酸鹽(XLD)瓊脂和HEKTOEN氏腸道菌(HE)瓊脂平板上。BS瓊脂平板于劃線接種的前一天制備好儲存在室溫暗處。

        4、再用3mm直徑的接種環, 從RV培養基(樣品為生鮮食物,嚴重污染的食品和動物飼料)和SC肉湯(除了生鮮食物,嚴重污染的食品和動物飼料以外其它樣品)取滿環(10μl),劃線接種于上述平板上。

        5、把選擇性平板置35℃培養24±2小時。

        6、檢查平板中可疑沙門氏菌菌落的存在。

        典型的沙門氏菌菌落形態:

        從每個經過24±2小時培養后選擇性平板上挑 取2個或更多個菌落。典型的沙門氏菌菌落如下:

        A、在HEKTOEN氏腸道菌(HE)瓊脂上。

        菌落呈蘭綠至蘭色,帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養物可呈現大的光澤黑色中心或幾乎全部黑色的菌落。

        B、在木糖賴氨酸去氧膽酸鹽(XLD)瓊脂上。

        粉色菌落,帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養物可有大的光澤黑色中心或呈幾乎全部黑色的菌落。

        C、亞硫酸鉍(BS)瓊脂上。

        呈褐色,灰色或黑色,有時帶有金屬光澤。菌落周圍的培養基通常開始呈褐色,但伴隨培養時間的延長而變為黑色,并有所謂的暈環效應。

        如果典型菌落出現在經24±2小時培養后的BS瓊脂上,則挑取2個或更多個典型菌落。不論BS瓊脂平板在培養24±2小時時是否挑取過菌落,BS平板再培養24±2小時。培養了48±2小時后,如果BS平板上出現典型菌,則挑取2個或更多個菌落,如果只在經過24±2小時培養的BS平板上挑取了菌落,接種到三糖鐵瓊脂(TSI)和賴氨酸瓊脂(LIA)上,會呈現非典型反應以至視為培養物中不存在沙門氏菌 。參見下面四.8部分和四.9部分,有關TSI和LIA反應的詳細描述。

        非典型的沙門氏菌菌落形態:

        不存在典型的或可疑的沙門氏菌菌落時,按如下步驟檢驗非典型的沙門氏菌菌落。

        A、HE和XLD瓊脂:

        非典型的沙門氏菌在HE和XLD瓊脂上呈黃色菌落,帶或不帶黑色中心。HE和XLD平板經24±2小時培養后,沒有典型的沙門氏菌菌落,則挑取2個或更多個非典型的沙門氏菌菌落。

        B、BS瓊脂:

        某些非典型菌株產生綠色菌落,其周圍培養基稍微或不呈暗色。如果BS平板培養24±2小時后,沒有出現典型菌落,則不挑取任何菌落,讓平板繼續培養24±2小時。如果經48±2小時培養后,仍沒有典型或可疑的菌落出現,則挑取2個或更多個非典型的菌落。

        7、用滅菌接種針輕輕地接觸每個菌落中心部位,接種TSI斜面,先在斜面上劃線,再于底層穿刺。不需灼燒接種針,即可接種LIA斜面,先穿刺接種底層兩次,再劃線斜面上。由于賴氨酸脫羧反應需嚴格厭氧條件,因而LIA斜面必須有深的底層(4cm)。將已挑過菌落的選擇性平板于5&#0;8℃儲存。

        8、將TSI和LIA瓊脂斜面于35℃分別培養24±2小時。當進行斜面培養時放松試管帽以保持需氧條件,以防止過量的H2S產生。

        在TSI瓊脂中,典型的沙門氏菌培養物使斜面呈堿性(紅色),底層呈酸性(黃色),產生或不產生H2S(瓊脂變黑色)。在LIA瓊脂中,典型的沙門氏菌培養物其試管底層呈堿性(紫色)反應。只有試管底層呈明顯黃色時才認為有酸性(陰性)反應。不要單純根據其試管底層產生的褪色反應就排除它。在LIA中,大多數沙門氏菌培養物皆產生H2S;一些非沙門氏菌培養物產生磚紅色反應。

        9、在LIA瓊脂上所有底層呈堿性反應的培養物,無論其在TSI瓊脂上反應如何,皆應全部保留為可疑的沙門氏菌分離物,并進一步做生化和血清學試驗。在LIA中呈酸性底層反應和在TSI中呈斜面堿性,底層酸性的培養物,均視為可疑的沙門氏菌分離物,應進一步做生化和血清學試驗。在LIA中呈酸性底層和在TSI中呈酸性斜面和酸性底層的培養物,可視為非沙門氏菌培養物而棄去。對所保留的擬定陽性TIS瓊脂培養物,可按下面四,10節敘述的進行檢測,是否為沙門氏菌,包括亞利桑那沙門氏菌。如果TSI中培養物沒有呈現沙門氏菌的典型反應(斜面堿性,底層酸性),再從未擬定陽性的選擇性平板上另外挑取可疑菌落,象上面四,7節所述的接種TSI和LIA斜面。

        10、生化和血清學鑒定試驗:

        a從亞硒酸鹽胱氨酸肉湯(或相應食品的RV培養基)劃線分離的選擇性瓊脂平板上所挑取的3個擬定陽性TSI瓊脂培養物和從四硫磺酸鹽肉湯劃線分離的選擇性平板所挑取的3個擬定陽性TSI瓊脂培養物,進行生化和血清學鑒定試驗。

        b如從一組選擇性瓊脂平板未分離出3個擬定陽性的TSI瓊脂培養物,則對其它已分離到的擬定陽性的TSI瓊脂培養物進行生化和血清學鑒定試驗。對所分析的每個25g樣品,至少應檢查6個TSI培養物。

      五、沙門氏菌的鑒定:

        1、混雜培養物:

        對呈混雜菌的TSI瓊脂培養物,皆應劃線接種于麥康凱(MC)瓊脂,HE瓊脂,或木糖賴氨酸去氧膽酸鹽(XLD)瓊脂上,于35℃培養24±2小時。檢查平板上可疑沙門氏菌存在與否。

        a、在麥康凱(MC)瓊脂上:

        典型菌落呈透明、無色,有時帶有暗色中心。沙門氏菌菌落有時可使培養基中其它細菌所造成的膽鹽沉淀區透明。

        b、在Hektoen氏腸道菌(HE)瓊脂上:見上述四,6a。

        c、在木糖賴氨酸去氧膽酸鹽(XLD)瓊脂上:見上述四,6b。

        按上面的四,6節所述轉種至少2個可疑沙門氏菌菌落到TSI瓊脂和LIA瓊脂斜面上,接下去按上述的四,8節進行鑒定。

        2、純培養物:

        a、尿素酶試驗(常規)。由每個擬定陽性TSI瓊脂斜面培養物,用滅菌針分別接種生長物到每個尿素肉湯試管中。偶爾也會有未接種的尿素肉湯管變紫紅色(試驗陽性),因而應包括未接種該肉湯管作為對照,于35℃培養24±2小時。

        b、可選的尿素酶試驗(快速法)。用3mm直徑接種環,自每一擬定陽性的TSI瓊脂斜面培養物中取2環轉種到快速尿素肉湯管中,37±0.5℃水浴中培養2小時。棄去所有呈陽性結果的培養物,保留所有陰性反應的(培養基不變色)培養物,為進一步研究試驗用。

        3、血清學多價鞭毛(H)試驗:

        a、此時或以后進行多價鞭毛(H)試驗,可按下面五,4節所述進行。從每個尿素酶陰性的TSI瓊脂斜面培養物接種到以下任一項, 1)腦心浸液肉湯,于35℃培養4&#0;6小時,直到可見的生長物出現(供當日試驗用),或2)胰胳胨大豆肉湯,于35℃培養24±2小時(供次日試驗用)。在各5mL肉湯培養物中加2.5mL甲醛生理鹽水溶液。

        b、選兩個以甲醛處理的肉湯培養物同沙門氏菌多價鞭毛(H)抗血清試驗。在10×75mm或13×100mm血清學試管內,加入0.5mL經合適稀釋的沙門氏菌多價鞭毛(H)抗血清,再加入0.5mL待測抗原進行試驗。并以0.5mL甲醛生理鹽水溶液同0.5mL甲醛處理的抗原混合好,制成鹽水對照,將各混合物于48&#0;50℃水浴培養,每隔15分鐘觀察一次初步結果,并于1小時讀數最終結果。

        陽性反應:在甲醛肉湯培養物與血清混合物中凝集,而在甲醛肉湯培養物與甲醛鹽水管中(對照管)不凝集。

        陰性反應:在甲醛肉湯培養物與血清混合物中(試驗混合物)不凝集,在對照管中也不凝集。

        非特異反應:在試驗混合物與對照管中皆出現凝集。對出現這類結果的培養物,需用“Spicer Edwars”氏抗血清做進一步試驗。

        4、尿素酶陰性培養物試驗:

        a、賴氨酸脫羧酶肉湯。如果所做的LIA試驗是滿意的,則不需重復試驗。如果培養物呈現可疑的LIA反應,則以賴氨酸脫羧酶肉湯進行賴氨酸脫羧酶的最終鑒定。將少量可疑沙門氏菌陽性TSI瓊脂斜面培養物接種至賴氨酸脫羧酶肉湯管。將試管帽旋緊,置于35℃培養48±2小時,至少每隔24小時檢查一次。沙門氏菌因堿性反應,則使整個培養基呈紫色。陰性反應則使整個培養基呈黃色。如果培養基出現褪色現象(即不呈紫色也不呈黃色),可加入幾滴0.2%溴甲酚紫溶液,然后再觀察試管的反應。

        b、酚紅衛茅醇肉湯或含有0.5%衛茅醇的紫色肉湯基礎液。由TSI瓊脂上取少量培養物接種至肉湯管中。將試管帽放松。置于35℃培養48±2小時,但24h后觀察反應。大多數沙門氏菌呈陽性實驗結果,表現為內部發酵管中產氣和培養基變酸(黃色)。產酸為陽性反應。陰性反應為倒管內無氣體產生。整個培養基呈紅色(有酚紅指示劑)或紫色(有溴甲酚紫指示劑)。

        c、胰蛋白胨(或色氨酸)肉湯。將少量TSI瓊脂培養物接種到肉湯管中,置35℃培養24±2小時,并按以下進行試驗。

        1)氰化鉀(KCN)肉湯。

        從24h色氨酸培養物移取3mm接種環一環轉種到KCN肉湯管中。將管口加熱,以便加塞時蠟封良好。35℃培養48±2小時,但24h后觀察反應。有生長者(有渾濁)為陽性。大多數沙門氏菌在此培養基中不能生長,即無渾濁現象。

        2)丙二酸鹽肉湯:

        用3mm接種環移取24h色氨酸肉湯培養物,轉種到丙二酸鹽肉湯管中。因偶爾會出現未接種的丙二酸鹽肉湯在存放期間變蘭(陽性反應),所以應有未接種的丙二酸鹽肉湯管作對照。35℃培養48±2小時,但在培養24h后觀察反應。大多數沙門氏菌培養物在此肉湯中為陰性反應(綠色或不變色)。

        3)吲哚試驗:

        轉種5mL24h色氨酸肉湯培養物到空試管中,加入0.2-0.3mLKovacs氏試劑,大多數沙門氏菌培養物為陰性反應(在肉湯表面無深紅色)。并記錄呈桔色和粉色變化的中間型為±反應。

        4)沙門氏菌血清學鞭毛(H)試驗:

        如果未做多價鞭毛(H)試驗或Spicer-Edwards氏鞭毛(H)試驗,可任選其一。

        5)吲哚試驗陽性和血清學鞭毛(H)試驗陰性;或者KCN試驗陽性和賴氨酸脫羧酶試驗陰性的非沙門氏菌任一培養物予以去除。

        5、沙門氏菌血清學菌體(O)試驗。(用已知沙門氏菌培養物同所有抗血清做予試驗)。

        a、多價菌體(O)試驗:

        用蠟筆在每個玻璃或塑料平板(15×100mm)內側劃出2個約1×2cm的區域?墒褂蒙唐坊姆謪^載玻片,用2mL0.85%生理鹽水乳化從24-48hTSI斜面或者更好是胰胨血瓊脂基礎(無血),用3mm接種環移取培養物。加1滴菌懸液于用蠟筆標出的每一矩形區域的上部。這一區域的下部加1滴生理鹽水。在另一區域加1滴沙門氏菌多價菌體(O)抗血清。再以干凈滅菌的接種環或針將一個區域內的菌懸液和生理鹽水混合。在另一區域內菌懸液和抗血清液混合。將混合液前后傾斜移動1min,并在良好照明下對著黑暗背景觀察,任何程度的凝集都視為陽性反應。多價菌體(O)試驗結果分類如下:

        陽性反應:混合物試驗凝集,而在鹽水對照中不凝集。

        陰性反應:混合物試驗不凝集,在鹽水對照中也不凝集。

        非特異性反應:混合物試驗和鹽水對照中皆凝集,需按Edwards和Ewing氏的腸桿菌科鑒定中所描述的進一步作生化學和血清學試驗。

        b、菌體(O)群試驗

        如有各群菌體(O)抗血清,包括Vi,代替沙門氏菌多價菌體(O)抗血清,按上述五,5a試驗。對Vi凝集反應陽性的可參照官方分析分析方法的967.28B部分專門處理這些培養物。與菌體(O)群抗血清呈陽性凝集的培養物,作該菌體(O)群陽性記錄;不能與菌體(O)群抗血清發生反應者,做該菌體(O)群試驗陰性記錄。

        6、補充生化試驗

        按表1中1-11項試驗,對培養物呈典型沙門氏菌反應者,進行沙門氏菌分類。如在25g分析樣品中有一個TSI培養物被劃為沙門氏菌,則該25g分析樣品的其他TSI培養物就無需進一步試驗。沙門氏菌鞭毛(H)試驗陽性表明有沙門氏菌抗原,但不具有沙門氏菌生化特性者,應對培養物作純分離(按上述五、1),按上述五、2開始重新做試驗。

        對表1中1-11項目,不呈典型沙門氏菌反應的培養物做以下補充試驗以最終判斷為非沙門氏菌。

        a、酚紅乳糖肉湯或紫色乳糖肉湯。

        1)從每個尚未分類的24-48hTSI瓊脂斜面上挑取少許培養物,接種到肉湯管中,35℃培養48±2h。并在24h后開始觀察變化。

        陽性反應:產酸(黃色)和在倒立發酵管內產氣。只要產酸就視為陽性反應。大多數沙門氏菌為陰性結果。即在倒立發酵管內沒有氣體形成,和整個培養基呈紅色(含酚紅指示劑)或紫色(含溴甲酚紫指示劑)。

        2)除培養物在TSI瓊脂斜面上產酸和在LIA中呈陽性反應,或丙二酸鹽肉湯試驗呈陽性的培養物外,棄去乳糖試驗陽性的非沙門氏菌培養物。為了證明他們是否為亞利桑那菌,需對這些培養物作進一步試驗。

        b、酚紅蔗糖肉湯或紫色蔗糖肉湯。

        按上述五,6a-1所敘述的程序進行,除那些培養物在TSI瓊脂斜面上產酸和在LIA中呈陽性反應者外,呈蔗糖試驗陽性結果者皆作為非沙門氏菌棄去。

        c、MR-VP肉湯。

        對每個未分類的TSI瓊脂斜面上可疑沙門氏菌培養物,挑取少許,接種到此肉湯管中,置于35℃培養48±2h。

        1)在室溫下按下述進行Voges-Proskauer氏(VP)試驗:

        移取1mL48h培養物于試管中,并將剩余的MR-VP肉湯于35℃再培養48h。加入0.6mLα-萘酚溶液于試管中并振搖;加40%KOH溶液0.2mL,并振搖。為了加快反應速度,加少許肌酸結晶。4h后觀察結果:陽性反應為整個培養基由粉紅色轉變至紅寶石色。絕大多數沙門氏菌VP試驗陰性,即整個肉湯不呈粉紅至紅色變化。

        2)甲基紅試驗:

        吸取經96h培養的MR-VP肉湯5mL于試管中,加入5-6滴甲基紅指示劑,立即觀察結果。絕大多數沙門氏菌培養物呈陽性結果,即培養基呈彌散性紅色。明顯的黃色為陰性結果。對KCN陽性,V-P試驗陽性及甲基紅試驗為陰性培養物,皆可作為非沙門氏菌棄去。

        d、Simmons氏枸櫞酸鹽瓊脂:

        從未分類的TSI瓊脂斜面上,用接種針沾取培養物,劃線接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上,并穿刺底層。置于35℃培養96±2h,按下述方法讀取結果。

        陽性反應:能生長,通常伴隨顏色由綠色變蘭色。大多數沙門氏菌培養物為枸櫞酸鹽陽性。

        陰性反應:不生長或微弱生長,而且不變色。

        7、培養物的分類:

        沙門氏菌培養物應具有表1反應模式。凡培養物具有表2所列任何一小項結果,為非沙門氏菌則棄去。對任何培養物,當不能按表1的分類表,明確地鑒定為非沙門氏菌屬,或也不能根據表2所列試驗反應從沙門氏菌屬中排除者,可按Edwards和Ewings氏的“腸桿菌科鑒定”所述的補充試驗進一步分類。

        如2個TSI培養物皆不能按生化試驗證實分離物為沙門氏菌時,則對同一個25g檢驗樣品中保留的尿素酶陰性TSI培養物,按五,4開始進行生化學試驗。

        8、沙門氏菌屬的擬定性鑒定。

        使用5種商品化的生物化學試劑盒(API 20E, Enterotube II, Enterobacter aceae II, MICRO-ID,或Vitek GNI)中任一種,代替常規的生化管系統,鑒定擬定食源性沙門氏菌屬。按本節鑒定所述,檢驗人員根據自己試驗室選擇商品試劑盒與生化管系統相適應的一種商品試劑盒。生化學商品試劑盒不能用來代替血清學試驗(1)。組裝試劑盒,配制試劑盒所需試劑。參照官方分析方法的978.24部分(API-20E, Enterotube II和Enterobacterlaceae II),989.12部分(MICRO-ID),和991.13部分(Vitek GNI),接種于每個組合,并按規定的時間與溫度進行培養。加試劑,觀察與記錄結果。參照上述Ref.1把培養物擬定為沙門氏菌或非沙門氏菌屬!

        為證實擬定為沙門氏菌的培養物,尚需進行沙門氏菌菌體(O)血清學試驗,按上述五,5;和沙門氏菌鞭毛(H)血清試驗,按上述五,3;或進行Spicer-Edwards氏鞭毛(H)試驗。并按下列原則對培養物進行分類:

        a、用商品化試劑盒擬定為沙門氏菌的培養物,若沙門氏菌菌體(O)血清學試驗陽性與沙門氏菌鞭毛(H)血清學試驗陽性的則報告為沙門氏菌。

        b、用商品化試劑盒確定為非沙門氏菌的培養物,參照AOAC標準(1)確定亦為非沙門氏菌,應作非沙門氏菌予以排除。

        c、凡不符合a或b的培養物,應按上述五,2-6項中有關規定作進一步試驗,或按Ewing(2)氏的有關項目進一步試驗,或送至標準定型實驗室,做最后的血清定型與鑒定。

        9、鞭毛(H)試驗陰性培養物的處理:

        對一些生化反應典型,被認為是沙門氏菌,但鞭毛(H)試驗陰性的培養物,可能是無動力的菌株,或鞭毛抗原發育不充分,對此培養物的動力測定方法如下:

        從TSI斜面上挑取少量的培養物,接種于動力試驗培養基平板中,在距平板邊緣10mm處一次穿刺2-3mm深,不要刺到平板底或接種到其他任何部位。置于35℃培養24h。如果細菌游散生長至40mm或更遠,按下述方法再試驗:在游散生長最遠處,用3mm接種環轉種一環培養物至胰酪胨大豆蛋白胨肉湯中。重復沙門氏菌多價鞭毛(H)(按上述五,3)或作Spicer-Edwards氏鞭毛(H)血清學試驗。如果培養物經第一個24h培養后無動力,于35℃培養24h;如果仍無動力,則置25℃再培養5天。如果上述試驗仍為陰性,把該培養物定為無動力菌株。如果鞭毛(H)陰性培養物,按生化學反應可疑為沙門氏菌,應將培養物呈送微生物學實驗室作進一步的鑒定和/或血清學分型。遞送血清學定型培養物,除非另有說明,每個檢驗樣品要遞送兩個分離物。培養物要放在腦心浸液瓊脂斜面的試管內遞送。試管的螺旋帽應擰緊以確保安全。

      六、控制:

        嚴格執行食品生產良好操作程序,注意滅蠅,加強對飲水、食品等的衛生監督管理,以切斷傳染途徑。對食品加工和飲食服務人員定期進行健康檢查,及時發現帶菌者并給以治療或調離工作崗位。加強屠宰業的衛生監督及各種食品特別是肉類運輸、加工、冷藏等方面的衛生措施,防止沙門氏菌污染。

        在食品加工過程中,必須嚴格按衛生規范防止二次污染,通過蒸煮、巴氏消毒、存放適宜溫度等進行控制,都能防止沙門氏菌病的發生。

      編輯:foodyy

       
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      關鍵詞: 沙門氏菌
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